镉(Cd)是一种重金属元素。镉污染对大多数生物体有毒,会破坏植物体内的生理生化反应,进而影响植物正常生长和发育,同时镉能通过食物链进入人体对人类健康构成潜在威胁。因BMS-354825 IC50此,研究植物响应镉胁迫相关基因功能及其调控植物镉胁迫机制具有重要的理论价值和现实意义。本课题以拟南芥丙酮酸脱羧酶家族的AtPDC4基因为对象,利用生物化学和分子生物学手段,探究其调控拟南芥镉胁迫的机制,主要结果如下:1 AtPDC4响应镉胁迫,基因功能缺失导致拟南芥对镉毒敏感AtPDC4基因在地上部和根中均有转录活性,受镉胁迫诱导上调表达。绿色荧光蛋白GFP标记的AtPDC4蛋白定位于细胞质,说明其在细胞质中发挥调节功能。相比于野生型拟南芥Col-0,AtPDC4功能缺失突变体(T-DNA插入)对镉胁迫(15μM Cd Cl_2)更敏感表现在主根长更短、地上部更小更黄。基于CRISPR/Cas9编辑的Atpdc4突变体表现出与T-DNA插入突变体一致的表型,说明AtPDC4是导致拟南芥镉胁迫敏感表型的决定基因。然而,在镉胁迫下超表达材料35S:AtPDC4与野生型Col-0相比没有表现出明显的生长优势,说明存在AtPDC4功能饱和效应。2 AtPDC4基因功能缺失引起镉胁迫下拟南芥的生理稳态紊乱镉胁迫下,相比于野生型Col-0,Atpdc4突变体中积累了更高的镉含量。同时,通过DHE(O_2~-)和HPF(H_2O_2)染色以及定量测定,结果表明Atpdc4突变体内也积累了更多的ROS(活性氧),导致MDA(丙二醛)水平更高。进一步测定发现SOD(超氧化物歧化酶)在突变体中没有改变,但POD(过氧化物酶)活性有显著下降,可能有助于突变体内ROS的累积。通过外源添加ROS清除剂As A(抗坏血酸)或GSH(还原型谷胱甘肽),发现两者均能部分缓解拟南芥的镉毒表型,但不改变Atpdc4突变体和Col-0对镉胁迫的敏感差异,说明ROS水平的改变不是引起Atpdc4镉胁迫敏感的主要原因。丙酮酸是PDC(丙酮酸脱羧酶)的天然底物。镉胁迫下Atpdc4突变体根中比Col-0根中累积了更多GDC-0973抑制剂的丙酮酸,这可能是引起镉胁迫敏感的原因。但外源添加丙酮酸反而能够缓解镉毒表型,说明突变体对镉毒更敏感的表型不是由丙酮酸积累引起的。中低水平镉胁迫(≤40μM)能够引起拟南芥根尖生长素累积。通过在Atpdc4背景下表达生长素指示材料DR5-GFP,显示AtPDC4功能的缺失抑制了根尖生长素对镉胁迫的响应。进一步测定确认了Atpdc4突变体根中比Col-0根中的生长素水平更低。这些结果表明镉胁迫下,AtPDC4功能对维持植株生理稳态十分重要。3 bHLHs-IRT1模块可能调控了Atpdc4突变体镉吸收通过比较分析镉胁迫下Col-0和Atpdc4突变体中镉吸收转运相关基因(HMA3/4,NRAMP1/3/4,IRT1)的表达水平,发现At IRT1的表达在突变体中显著高于Col-0。IRT1是二价阳离子(Fe~(2+),Cd~(2+)等)转运蛋白。Cd~(2+)和Fe~(2+)竞争IRT1转运子进入细胞内。Atpdc4中At IRT1的上调必然导致更多的镉进入体内,同时体内处于缺铁状态。由于镉胁迫下Atpdc4累积更多的铁,因此推测为Fe~(3+)离子富集。镉胁迫下进行Fe~(3+)染色证实Atpdc4中Fe~(3+)含量高于Col-0。同时,测定细胞壁中Fe~(3+)含量,测Medicare Health Outcomes Survey定结果与染色结果一致。说明AtPDC4功能缺失引起Fe~(3+)累积。进一步研究发现,相较于Col-0,Atpdc4突变体中At IRT1上游转录因子bHLH家族基因AtbHLH38,AtbHLH39,AtbHLH100的表达均有不同程度的上升,说明这些转录因子基因强化了At IRT1基因的表达,从而增加了Atpdc4中镉的累积,引起镉敏感表型。因此,bHLHs-IRT1模块可能调控了Atpdc4突变体镉吸收。