磺胺类药物(sulfonamides,SAs)是一类人工合成的广谱抗菌药,其不合理使用造成了在动物性食品中的残留问题,从而危害消费者的健康。因此,迫切需要经济高效、省时省力、高通量的检测方法对SAs的残留进行监测。本研究制备了两种二氢叶酸合成酶(Dihydropteroate Synthase,DHPS)并分别进行定向进化,然后分别以这四种DHPS为识别试剂建立了四种检测方法对动物性食品中的SAs进行多残留检测。首先,体外表达了金黄色葡萄球菌二氢叶酸合成酶(Starecurrent respiratory tract infectionsphFG-4592体内ylococcus aureus DHPS,SaDHPS),并以其为识别试剂,建立了一种荧光偏振检测法(FPA)对鸡肉中的31种SAs进行检测。结果表明,该方法单次检测可在5分钟内完成,对31种SAs的检测限为2.0-38.5 ng/g。并且,31种SAs的IC50与SaDHPS-SAs间的亲和力大小变化趋势一致。分子对接结果表明,31种磺胺类药物的母核结构均位于SaDHPS的结合腔中,侧链则均在结合腔之外,SaDHPS-SAs之间的分子间力主要为氢键和疏水键,关键接触氨基酸为Gly171和Lhttps://www.selleck.cn/products/iacs-010759-iacs-10759.htmlys203,主要识别位点为SAs的对氨基苯磺酰胺部分。其次,将SaDHPS结合腔中的Arg204、Pro216分别突变为His和Arg,表达出SaDHPS突变体。分子对接显示该突变体对大多数SAs的结合能力升高,其原因为氢键和cation-Pi键数量的增加。以该突变体为识别试剂建立了一种信号增强型荧光偏振检测法对猪肉中35种SAs进行检测。结果表明,该方法对35种SAs的检测限为0.15-5.58 ng/g,灵敏度比普通荧光偏振检测法提高了 2.8-8.6倍。然后,合成了一种磁性光亲和标记-活性蛋白谱探针,从大肠杆菌中直接“钓取”到了一种天然DHPS(Escherichia coli DHPS,EcDHPS)。以其为识别试剂,建立了一种信号放大型直接竞争检测法对猪肉中的40种SAs进行检测。结果表明,该方法对40种SAs的检测限为0.001-0.016 ng/g,灵敏度比普通直接竞争检测法提高了 32-88倍。并且44种SAs的IC50与EcDHPS-SAs间的亲和力大小变化趋势一致。分子对接结果表明,SAs与EcDHPS间的关键氨接触基酸为Lys221、Ser222、Arg63和Pro64。最后,将天然EcDHPS结合腔中的关键氨基酸Ser222突变为Arg,表达出了一种EcDHPS突变体。该突变体对44种SAs的结合能和亲和力均有明显的提升。以该突变体为识别试剂,建立了一种信号放大型直接竞争荧光检测法,对牛奶中的这44种SAs进行检测。结果表明,该方法对这44种SAs的检测限为0.025-0.65 ng/mL,灵敏度比普通直接竞争荧光检测法提高了 6-86倍。综上,本研究通过体外表达方法和磁性探针捕获方法制备了两种细菌来源的DHPS,并分别进行了定向进化获得了具有更高亲和力的突变体。并通过分子对接和表面等离子共振实验,探究了所制备的4种DHPS与SAs间的相互作用机制。然后分别以这4种DHPS为识别元件,建立了 4种SAs多残留快速检测方法。这4种检测方法可作为动物性食品中SAs多残留筛查的实用工具,对保障食品安全、维护消费者健康具有重要意义。