选题依据:黄芪多糖是黄芪中免疫调节活性最强,含量最为丰富的物质之一,还具有抗肿瘤,抗糖尿病等多种生物活性。已证明黄芪多糖组分APS-Ⅱ是黄芪发挥免疫活性的主要物质基础。然而由于多糖分子量大,结构难于测定,限制了黄芪多糖构效关系的深入研究。效仿蛋白质结构研究方式,采用自下而上,将多糖降解为寡糖,结合质谱技术,是目前研究多糖结构的重要途径之一。前期课题组采用α-1,4-葡聚糖内切酶将APS-Ⅱ降解为寡糖,将不同聚合度寡糖制备为四个组分1～3糖、3～6糖、7～14糖和10～18糖,通过体外免疫活性筛选发现7～18糖具有较强的免疫活性。对四个组分寡糖进行单糖组成、连接位点以及高分辨质谱负离子解析,发现2～9糖均为α-1→4连接的线性葡聚糖,并得出APS-Ⅱ酶解寡糖的活性与C-2和C-6支化程度密切相关的结论。但前期研究中10糖以上以及糖链分支结构不明确,缺少糖链序列结构信息以及存在的同分异构体的寡糖结构也未能得到解析。全甲基化不仅可以提高糖链在MS检测中的灵敏度,还可以简化糖链分子在MS/MS和MSn中的裂解过程,裂解更具有规律性,适用于糖链序列结构解析。同时全甲基化可以降低糖链极性,使得全甲基化糖链在RP-HPLC反相柱中更容易得到分离,有利于APS-Ⅱ酶解寡糖中同分异构体的分离分析。因此本研究将基于非衍生化和衍生化(全甲基化)两种方式结合高分辨质谱(正离子)对APS-Ⅱ酶解寡糖进行结构解析和验证。研究结果为获取丰富精确的黄芪寡糖结构信息以及为阐明黄芪多糖免疫促进活性的构效关系奠定基础。目的:利用离子色谱,气质(GC-MS)甲基化分析、核磁共振波谱(NMR)对APS-Ⅱ单糖组成,连接方式进行分析,对α-1→4连接葡聚糖2～8糖标品进行非衍生化和全甲基化高分辨质谱裂解规律研究。采用MALDI-TOF-MS对APS-Ⅱ酶解寡糖进行分子量表征并结合高分辨质谱对非衍生化和全甲基化酶解寡糖结构进行解析和验证,找出同分异构体寡糖,明确支链结构信息。研究方法:1.通过DEAE-52对免疫活性组分APS-Ⅱ进行分离纯化,结合离子色谱对APS-Ⅱ中中性和酸性多糖组分进行单糖组成分析,同时采用GC-MS以及NMR对APS-Ⅱ中糖残基连接方式,异头碳构型进行分析。2.对免疫活性组分APS-Ⅱ进行酶降解,采用MALDI-TOF-MS和ESI-Q Exactive-MS高分辨质谱(正离子)对α-1→4连接葡聚糖标品2～8进行裂解规律研究以及对APS-Ⅱ酶解后寡糖进行分子量表征和结构序列解析。3.对α-1→4连接葡聚糖标品2～8和APS-Ⅱ酶解后的寡糖进行衍生化(全甲基化),通过采用MALDI-TOF-MS和ESI-Q Exactive-MS高分辨质谱(正离子)对全甲基化α-1→4葡聚糖标品2～8裂解规律进行研究,以及对APS-Ⅱ酶解后全甲基化的寡糖进行结构解析,包括酶解寡糖同分异构体的解析。研究结果:1.本研究采用离子色谱对APS-Ⅱ单糖组成进行分析,得出水洗组分,0.2 mol·L-1NaCl组分,0.5 mol·L-1NaCl组分和1.0 mol·L-1NaCl组分四个组分单糖组成及摩尔比,表明APS-Ⅱ存在部分酸性糖链,含量占比为10%。水洗组分为中性多糖,主要以葡萄糖为主;在NaCl洗脱组分中首次发现了木糖、甘露糖,盐酸氨基半乳糖、盐酸氨基葡萄糖等单糖种类。对不同浓度NaCl洗脱组分中单糖绝对含量分析得出,推测鼠李糖与半乳糖醛酸存在同一酸性糖链中,阿拉伯糖与半乳糖存在同一酸性糖链中,木糖、甘露糖和葡萄糖醛酸存在同一酸性糖链中,为APS-Ⅱ酸性糖链的结构解析提供单糖组成基础。同时采用GC-MS和NMR对APS-Ⅱ单糖连接方式进行分析,得出APS-Ⅱ中主要存在糖残基连接方式为→4)-(α-D-Glcp-(1→,→6)-α-D-Glcp-(1→,同时存在→4,6)-α-D-Glcp-(1→,→2,4)-α-D-Glcp-(1→等分支位点。1→4 和 1→6 的连接方式与2,6位的分支结构可能是APS-II发挥免疫促进活性的关键结构。2.本研究主要采用MALDI-TOF-MS对1-4连接葡聚糖2～8糖标品进行分子量分析,得到分子离子峰,并通过ESI-Q Exactive-MS高分辨质谱技术对相应分子离子峰进行二级碎片提取,分析1→4连接葡聚糖2～8裂解规律,1→4连接主要发生0,2An跨环断裂,产生质量数为60中性丢失。寡糖分子离子加和物主要为Na+,钠化低聚糖可以观察到3个主要的解离通道,即糖苷键断链、跨环解离(CnH2nOn低聚物中性丢失)和脱水,脱水反应和交叉环解离主要发生在还原端的异头碳上,即跨环断链主要产生A型离子;从跨环解离中性丢失m=18和90表明存在1→3连接;中性丢失m=18和60表明存在1→4连接;中性丢失m=18、60和120表明存在1→6连接。通过内切α-1,4-葡聚糖内切酶对黄芪多糖APS-Ⅱ降解,采用MALDI-TOF-MS对寡糖混合物中寡糖分子量进行表征,根据分子量得出寡糖混合物中主要存在3种类型离子分别为 Hexn,1079.7213(unknownGSK126)+Hexn,947.2261(unknown)+Hexn。但 1079.7213(unknown)+Hexn,947.2261(unknown)+Hexn 两种类型离子通过色谱分离后,通过ESI-QExactive-MS高分辨质谱未能找到对应的二级碎片信息,推测糖链中存在较多酸性糖,色谱分离条件未能将酸性糖链进行分离分析。因此通过ESI-Q Exactive-MS对Hexn中2～14糖进行结构表征。2～5糖为线性α-1→4连接的葡聚糖,6 糖为 α-D-Glcp-1→(4-α-D-Glcp-1)4→6-α-D-Glcp,7 糖为 α-D-Glcp-1→(6-α-D-Glcp-1)5→6-α-D-Glcp,8 糖为 α-D-Glcp-1→(6-α-D-Glcp-1)6→6-α-D-Glcp,9 糖为α-D-Glcp-1→4-α-D-Glcp→(6-α-D-Glcp-1)3→4-α-D-Glcp→(6-α-D-Glcp-1)2→6-α-D-Glcp,10 糖为 α-D-Glcp-1→4-α-D-Glcp→(6-α-D-Glcp-1)3→(4-α-D-Glcp)3→(6-α-D-Glcp)2,11 糖为 α-D-Glcp-1Medication for addiction treatment→4-α-D-Glcp→(6-α-D-Glcp-1)5→(4-α-D-Glcp)2→(6-α-D-Glcp)2,12 糖为 α-D-Glcp-1→4-α-D-Glcp→(6-α-D-Glcp-1)4→(4-α-D-Glcp-1)4→6-α-D-Glcp,13 糖为 α-D-Glcp-1→(6-α-D-Glcp-1)2→4-α-D-Glcp→(6-α-D-Glcp-1)3→(4-α-D-Glcp)6,14糖为α-D-Glcp-1-(4-α-D-Glcp-1)4→(6-α-D-Glcp-1)3→(4-α-D-Glcp)6。其中10～14糖共有结构为→(6-α-D-Glcp-1)3→4-α-D-Glcp-1→。相比于2～8糖,9～14糖中则出现了1→4和1→6两种连接方式共存的糖链。推测1→4和1→6连接共存的葡聚糖链可能为APS-Ⅱ中发挥免疫促进活性的关键结构。3.本研究对全甲基化葡聚糖和黄芪多糖APS-Ⅱ酶解寡糖进行MALDI-TOF-MS分子量表征,并将MALDI-TOF-MS中寡糖分子离子峰在ESI-Q Exactive-MS高分辨质谱中进行分子离子峰的提取以及结构解析。全甲基化葡聚裂解规律表明随着糖链的延长,呈现相同的裂解规律,糖苷键断裂主要产生C型断裂,并伴随丢失一分子甲醇(32)和一分子甲醛(30)的可能性以及结合一分子水丢失48和50的分子量,有的还会丢失两分甲醇和两分子甲醛丢失64和60的分子量。跨环断裂主要为2,4A,3,5A以及1，5X断裂,分别产生丢失148+204n,134+204n以及176+204n的碎片离子,因此相同类型断裂中相邻离子则相差204的倍数。此外还原端糖基发生异头碳引发的跨环断裂主要产生111,155等相差44的碎片离子。2,4A,3,5A跨环断裂均selleckchem BIBW2992符合1→4连接的RDA裂解机理,根据RDA裂解模式可以推断出其它连接方式下糖链裂解的特征碎片离子,1→6连接主要发生0,4A,3,5A跨环断裂,1→2连接主要发生3,5X跨环断裂。2,4A,0,4A分别为1→4糖苷键和1→6糖苷键特征跨环断裂方式,产生148+204n和301+204n的特征碎片离子。根据上述不同连接方式裂解规律,对APS-Ⅱ酶解寡糖聚合度为2～11糖中20种寡糖片段进行解析,其中二糖1种,三糖2种为3a,3b,四糖2种为4a,4b,五糖2种为5a,5b,六糖2种为6a,6b,七糖2种为7a,7b,八糖3种为8a,8b,8c,九糖3种为9a,9b,9c,十糖2种为10a,10b,十一糖1种。二糖,3b,4a,5a,6a,7b,8b,9a,10a以及十一糖解析结果与非衍生解析结果相互验证。二糖,3b,4a,5a,7b和8b线性1→4连接葡聚糖,7a和8a为线性1→6连接葡聚糖,5b,6b,9a,10a,十一糖存在1→6连接和1→4连接两种连接方式,结构分别为 α-D-Glcp-1→4-α-D-Glcp-1→6-α-D-Glcp→4-α-D-Glcp-1→4-α-D-Glcp-1,α-D-Glcp-1→4-α-D-Glcp-1→6-α-D-Glcp-1→(4-α-D-Glcp-1)2→4-α-D-Glcp-1,α-D-Glcp-1→4-α-D-Glcp-1→(6-α-D-Glcp-1)3→4-α-D-Glcp-1→(6-α-D-Glcp-1)3,α-D-Glcp-1→4-α-D-Glcp→(6-α-D-Glcp-1)3→(4-α-D-Glcp)3→(6-α-D-Glcp-1)2,α-D-Glcp-1→4-α-D-Glcp→(6-α-D-Glcp-1)5→(4-α-D-Glcp)2→(6-α-D-Glcp-1)2,8c,9c和10b存在→4,6)-Glcp-(1→分支结构,主链为1→4连接的葡聚糖主链,在还原末端糖残基C-6位存在1→6和1→4两种连接方式共存的支链结构。结构分别为:4α和9b存在→2,4)-Glcp-(l→分支结构,主链为1→4连接或者1→4和1→6两种连接方式共存的葡聚糖链,在还原末端→4)-α-D-Glcp-(1→的2位存在l→2连接的分支结构。结构分别为:推测→4,6)-α-D-Glcp-(1→,→2,4)-α-D-Glcp-(1→等含有分支结构的糖链和1→4和1→6两种连接方式共存的支链结构为APS-Ⅱ发挥免疫活性的关键结构。结论:APS-Ⅱ是黄芪发挥免疫活性的主要物质基础。前期课题组采用α-1,4-葡聚糖内切酶将APS-Ⅱ降解为寡糖,通过体外免疫活性筛选和结构解析得出2～9糖活性差,主要是→4)-α-D-Glcp-(1→糖链,10糖以上活性强但其结构由于质谱采集范围限制未进行解析,且具有免疫活性的分支结构信息不明确,缺少发挥免疫活性的关键结构信息。因此本研究采用“自下而上的”降维思路,将多糖降解为寡糖,采用离子色谱、高分辨质谱(MALDI-TOF-MS、ESI-Q Exactive-MS)、600 M核磁等多种结构表征技术。首次发现了木糖、甘露糖,盐酸氨基半乳糖、盐酸氨基葡萄糖等单糖种类。探究了非衍生化和全甲基化寡糖链1→4、1→6、1→2等不同糖苷键的裂解规律,并对聚合度2～14中23种糖链片段进行解析。其中2～5糖主要为线性1→4连接葡聚糖,还原末端含有1→6连接方式,7～8糖存在线性1→6连接葡聚糖,8～14糖主要为1→6和1→4两种连接方式共存糖链,部分同分异构体寡糖且存在→4,6)-α-D-G1cp-(1→,→2,4)-α-D-Glcp-(1→等具有免疫活性的关键分支结构。随着糖链聚合度的增加分支结构和1→6连接方式的比例均在增加,可能对黄芪多糖发挥免疫活性具有重要的作用。本研究对黄芪寡糖及多糖构效关系的研究以及阐明黄芪多糖发挥免疫活性的药效物质基础具有重要意义,同时也为黄芪寡糖的开发利用和黄芪多糖的质量控制研究提供依据。