【背景】急性肺损伤(ALI)/急性呼吸窘迫综合征(ARDS)是常见的临床急危重症,常继发于脓毒症,导致机体严重的肺部感染和细胞的死亡。研究表明铁死亡参与脓毒症诱导的急性肺损伤。目前急性肺损伤仍缺乏确切的治疗手段。间充质干细胞治疗作为一种新型的治疗方法,已得到广泛的研究,但是在应用到临床时其疗效仍有待提高。对间充质干细胞进行基因编辑是一种提高其治疗效果的有效手段。而TSG-6是间充质干细胞发挥治疗作用的重要旁分泌物质。本研究探讨应用过表达TSG-6基因质粒载体包装的慢病毒侵染的人脐带间充质干细胞对脓毒症诱导的急性肺损伤小鼠的治疗作用以及与铁死亡的相关性。【实验目的】探究过表达TSG-6基因的h UCMSCs对CLP诱导的小鼠急性肺损伤模型的治疗作用及与铁死亡的相关性。【实验方法】(1)人原代脐带间充质干细胞获赠于博品(上海)生物医药科技有限公司,在专用的h UCMSCs培养基中培养,定期于显微镜下观察,细胞持续生长直至融合达80-90%,传代至第3代时取部分h UCMSCs进行流selleck GSK J4式分析,检测与鉴定其表面标志物CD34、CD73、CD90及CD105的表达。(2)构建过表达TSG-6基因的h UCMSCs:慢病毒过表达载体FUW-tet O-lox P-h NANOG经过酶切电泳鉴定后,与扩增得到TSG-6基因的CDS序列通过同源重组构建FUW-tet O-lox P-h TSG-6慢病毒表达载体。载体经双酶切鉴定及测序验证成功后,使用三质粒包装系统将重组质粒FUW-tet O-lox P-h TSG-6与慢病毒辅助包装p MD2.G、ps PAX2和FUW-M2rt TA共转染293T细胞。收集慢病毒并感染h UCMSCs,实时荧光定量PCR(RT-q PCR)检测目的基因在h UCMSCs中的表达。(3)构建小鼠急性肺损伤动物疾病模型:将80只C57BL/6小鼠随机分为4组,分别为假手术组、CLP模型组、CLP+MSCs、CLP+TSG-6-MSCs治疗组,模型构建成功后4小时通过尾静脉注射给药的方式将PBS、MSCs、TSG-6+MSCs按不同分组情况注入小鼠体内,造模后密切观察小鼠的一般情况,于模型成功后24h麻醉小鼠并收集小鼠血浆、肺泡灌洗液及肺组织等样品。(4)通过称量及计算肺组织干-湿重量比、血浆及肺泡灌洗液炎症因子ELISA检测、肺组织HE染色及绘制小鼠生存曲线,明确肺部病变情况,确定造模成功,同时分析MSCs是否对ALI起到治疗作用,并且过表达-TSG-6 h UCMSCs是否在原有基础上提高了MSCs对ALI的治疗能力。(5)选取各组小鼠右肺组织行蛋白免疫印迹法和RT-qPCR检测铁死亡相关指标GPX4、SLC7A11分子表达情况,平行检测肺组织GSH、MDA的含量。【结果】(1)在倒置显微镜下观察,可见h UCMSCs贴壁生长,形态均一且为梭形,细胞呈旋涡状生长,随着培养时间增加细胞呈类纤维细胞样并趋于融合。流式分析表面标志性分子CD34低表达(<0.5%),CD73、CD90、CD105均为特异性表达(分别为96.64%、99.244%、95.87%),说明收集到的间充质干细胞符合鉴定标准;可用其继续完成后续实验。(2)成功构建了FUW-tet O-lox P-h TSG-6慢病毒过表达载体,病毒感染h UCMSCs后RT-q PCR检测到稳定、过表达目的基因。(3)小鼠体内实验中,对比各组HE染色情况可发现,对照组肺泡壁未见增厚、肺泡之间的间隔无充血、增宽,也未见炎性渗出;而疾病模型组肺泡壁所含毛细血管扩张严重,肺泡壁充血,肺泡及肺泡壁内大量炎性细胞浸润,两组MSCs治疗组情况介于对照组和急性肺损伤组之间,并且过表达-TSG-6组治疗效果要优于单纯的MSCs治疗组。与对照组相比,ALI模型组小鼠的肺组织病理切片损伤评分明显增高,而单纯的MSCs治疗组和TSG-6-MSCs治疗组的评分均较ALI模型组有明显降低的趋势,组间差异具有统计学意义(p<0.05),并且TSG-6-MSCs治疗组的评分较MSCs治疗组更低(p<0.05)。(4)对比不同分组的肺组织干-湿比同样可以发现,ALI疾病模型组wet-dry比值明显升高(p<0.05),单纯MSCs治疗组次之(p<0.05),但TSG-6-MSCs治疗组改善最为明显(p<0.05)。(5)对各组血浆和肺泡灌洗液的炎症因子检测结果对比可见,模型组小鼠体内炎症因子IL-6、TNF-α、IL-10的表达水平明显升高,说明盲肠结扎穿孔术成功导致了小鼠体内出现脓毒症,并且出现了急性肺损伤;通过注射MSCs治疗后,小鼠全身及肺部的促炎因子表达水平下降,而TSG-6-MSCs组和MSCs组相比,能更大程度地降低促炎因子的表达,提高抑炎因子IL-10的水平(p<0.05)。(6)生存曲线对比:造模后4-6小时即可观察到模型组小鼠出现畏寒、震颤,抱团取暖等表现,同时双眼、肛门排泄物增多,毛发杂乱,随着时间增加,出现呼吸急促、活动迟Dolutegravir小鼠缓甚至死亡等情况。MSCs的治疗延长了小鼠的生存时间,当MSCs过表达TSG-6后,小鼠的生存率得到提高。(7)分析不同组别肺组织的蛋白免疫印迹、RT-qPCR、免疫荧光染色及GSH、MDA含量检测,发现在CLP模型小鼠中,铁死亡核心蛋白GPX4及SCL7A11表达下调、肺组织谷胱甘肽含量减少、氧化应激产物MDA水平上升,说明在该模型中,肺组织损伤后出现细胞铁死亡;而MSCs注射后铁死亡核心蛋白GPX4及SCL7A11表达上调,GSH含量增加,MDA含量下降;过表达TSG-6可进一步改善铁死亡指标,数据均具有统计学差异(p<0.05)。【结论】(1)实验成功构建了CLP小鼠肺损伤模型Cytogenetics and Molecular Genetics及过表达TSG-6-h UCMSCs。(2)实验结果表明过表达TSG-6的h UCMSCs可加强其免疫调节能力,进一步改善CLP诱导的急性肺损伤;(3)CLP诱导的急性肺损伤存在铁死亡,h UCMSCs可能通过改善小鼠体内炎症水平间接减轻了肺组织铁死亡水平且与GPX4-SL7A11相关,可进一步探索两者之间的具体机制。