第一部分 热射病大鼠的心功能损伤及炎症反应与铁死亡作用的初步研究目的建立热射病大鼠动物模型,初步探究高温干预过程对大鼠心功能的影响及高温干预后恢复过程中炎性通路蛋白与铁死亡相关蛋白的变化趋势,并寻找出最佳时间点以初步探究热射病与铁死亡之间的联系。方法(1)18只雄性SD大鼠随机分为对照(Control)组与热射病(HS)组,Control组3只,HS组15只。肛温计检测大鼠核心体温;BL-420F生物机能实验系统检测大鼠HR及MAP。(2)将上述HS组大鼠按照不同恢复时长分为0h组,3h组,6h组,12h组及24h组,每组3只。ELISA检测大鼠c Tn I;Western blotting检测不同恢复时间点TLR4、NF-κB、p53、SLC7A11和GPX4蛋白表达水平;超声检测心功能指标:SV、CO、LVPWd和LVPWs;BL-420F生物机能实验系统检测心脏血流动力学指标:LVSP、LVEDP、左+dp/dt_(max)及-dp/dt_(max);H&E染色检测大鼠心肌组织病理学形态结构。(3)24只SD大鼠随机分为Control组、铁死亡抑制剂(Liproxstatin-1)组、HS组与HS+Liproxstatin-1组,每组6只。建模前30 min,Liproxstatin-1组和HS+Liproxstatin-1组腹腔注射liproxstatin-1(10 mg/kg)。免疫荧光染色检测大鼠心肌组织中SLC7A11蛋白表达水平;Western blotting检测大鼠心肌组织中SLC7A11与GPX4表达水平。结果(1)直肠温度检测结果显示,与Control组比较,HS组大鼠高温干预60 min后体温上升速度明显加快,并在180 min时显著增加(P<0.01);BL-420F生物机能实验系统检测结果显示,在高温干预过程中,与Control比较,HS组大鼠高温干预120 min后心率上升速度明显加快,并在180 min时达到峰值(P<0.01);与Control比较,HS组大鼠高温干预60 min后MAP明显升高,在90 min时达到峰值并维持至120 min,120min后MAP显著降低(P<0.05)。(2)与Control组比较,HS组大鼠高温干预后恢复3h时,c TnⅠ含量开始增加,并在恢复12h时显著增加(P<0.01);Western blotting检测结果显示,与Control组比较,HS组在高温干预后恢复12h时大鼠心肌组织中TLR4、NF-κB及p53蛋白表达显著增加(P<0.01),SLC7A11与GPX4蛋白表达显著减少(P<0.01);超声检测结果显示,Control组大鼠SV、CO、LVPWd和LVPWs正常;与Control组比较HS组大鼠SV、CO明显降低(P<0.01),LVPWd与LVPWs明显增加(P<0.01);在高温干预后恢复12h,Control组大鼠血流动力学指标正常;与Control组相比,HS组大鼠LVSP显著下降(P<0.01),LVEDP明显增多(P<0.05),+LVdp/dt_(max)显著下降(P<0.05),-LVdp/dt_(max)明显升高(P<0.05);H&E染色结果显示,Control组心肌结构规整清晰,心肌细胞呈梭形,细胞核居中;与Control组相比,HS组见部分心肌排列紊乱、形态不规则或模糊不清,部分胞质深染肥大,细胞间质可见大量炎性细胞浸润。(3)免疫荧光染色结果显示,与Control组比较,HS组大鼠心肌组织中SLC7A11表达明显减少(P<0.01);与HS组比较,HS+Liproxstatin-1组SLC7A11表达明显PLX3397改善(P<0.01);Western blotting检测结果显示,与Control组比较,HS组大鼠心肌组织中SLC7A11、GPX4表达水平明显下降(P<0.05);与HS组比较,HS+Liproxstatin-1组大鼠SLC7A11、GPX4表达水平明显改善(P<0.05)。结论热射病大鼠核心体温明显增加、心率显著升高并伴有低血压;在高温干预后恢复12h时热射病大鼠心功能明显异常,心肌组织结构严重损伤,TLR4/NF-κB炎性信号通路蛋白高表达,p53/SLC7A11/GPX4铁死亡通路蛋白中,p53表达增加,SLC7A11和GPX4表达减少,据此,高温干预后恢复12h可作为本研究动物实验最佳研究时间点。第二部分 抑制TLR4对热射病大鼠心功能及炎症反应与铁死亡的影响目的通过抑制TLR4探究其在热射病大鼠心功能损伤及炎症反应与铁死亡的作用。方法将36只SD大鼠随机分为Control组、TAK-242组、HS组与HS+TAK-242组,每组9只。建模前30 min,TAK-242组和HS+TAK-242组腹腔注射TAK-242(3 mg/kg)。BL-420F生物机能实验系统检测心脏血流动力学指标:LVSP、LVEDP、+dp/dt_(max)及-dp/dt_(max);超声检测心功能指标:SV、CO、LVPWd及LVPWs;H&E染色检测大鼠心肌组织病理学形态结构;RT-q PCR和Western blotting检测TLR4、NF-κB、p53、SLC7A11和GPX4 mRNA及蛋白的表达水平;免疫荧光染色检测心肌组织中TLR4蛋白表达水平;免疫组织化学检测NF-κB、p53、SLC7A11和GPX4蛋白表达水平;ELISA检测大鼠血清中c Tn I、TNF-α、IL-6和IL-1β含量;试剂盒检测大鼠血清中Fe~(2+)含量。结果Control组大鼠SV、CO、LVPWd和LVPWs正常;与Control组比较TAK-242组大鼠SV、CO、LVPWd和LVPWs无明显差异(P>0.05),HS组大鼠SV、CO明显降低(P<0.01),LVPWd与LVPWs明显增加(P<0.01);与HS组比较,HS+TAK-242组SV、CO增加,LVPWd和LVPWs降低(P<0.05)。Control组大鼠血流动力学指标正常;与Control组比较,TAK-242组大鼠血流动力学指标无明显差异(P>0.05),HS组大鼠LVSP(P<0.01)、+dp/dt_(max)(P<0.05)下降,LVEDP、-dp/dt_(max)增加(P<0.01);与HS组比较,HS+TAK-242组血流动力学指标改善,LVSP、+dp/dt_(max)升高,LVEDP、-dp/dt_(max)降低(P<0.05)。H&E染色结果显示,Control组心肌结构正常;与Control组相比,HS组见部分心肌排列紊乱,部分心肌细胞肥大、胞质深染,细胞间质可见大量炎症细胞浸润;HS+TAK-242组可见心肌细胞排列较HS组整齐,肥大的心肌细胞数量减少,细胞间质仍可见炎症细胞浸润,但较HS组减轻。与Control组比较,TAK-242组大鼠血清中c TnⅠ含量无明显变化(P>0.05),HS组c TnⅠ含量显著增加(P<0.01);与HS组相比,HS+TAK-242组c TnⅠ含量显著减少(P<0.05);RT-q PCR与Western blotting检测结果显示,与Control组比较,HS组大鼠心肌组织中TLR4、NF-κB和p53 mRNA及蛋白表达水平明显增高(P<0.01),SLC7A11、GPX4 mRNA及蛋白表达水平明显下降(P<0.01);与HS组比较,HS+TAK-242组TLR4、NF-κB和p53 mRNA及蛋白表达水平明显降低,SLC7A11和GPX4 mRNA及蛋白表达水平明显升高(P<0.05)。免疫荧光染色检测结果显示,与Control组比较,TAK-242组大鼠心肌组织中TLR4表达无明显差异,HS组部分心肌组织中TLR4表达明显增高;与HS组比较,HS+TAK-242组心肌组织中TLR4表达明显降低。免疫组化结果显示,与Control组比较,TAK-242组大鼠心肌组织中NF-κB、p53、SLC7A11和GPX4表达无明显差异,HS组部分心肌组织中NF-κB、p53表达明显增高,SLC7A11和GPX4表达显著减少;与HS组比较,HS+TAK-242组心肌组织中NF-κB、p53表达明显降低,SLC7A11和GPX4表达显著增多。结论TLR4可作为探究热射病大鼠心功能结构保护机制的重要靶点之一,抑制TLR4可显著改善热射病大鼠心功能损伤和心肌组织结构损伤,其机制可能与TAK-242下调TLR4/NF-κB信号通介导的炎症反应及p53/SLC7A11/GPX4信号通路介导的铁死亡相关。第三部分抑制TLR4/NF-κB信号通路对H9C2大鼠心肌细胞炎症反应与铁死亡的影响目的探究高温干预对H9C2大鼠心肌细胞形态结构及活力影响,并明确TLR4/NF-κB信号通路在高温干预导致的心肌细胞炎症反应与铁死亡中的作用。方法(1)37℃组、41℃组、43℃组和45℃组。免疫荧光检测α-actinin标记的H9C2细胞的细胞形态结构;CCK-8检测不同温度时细胞活力。(2)Control组、2h组、3h组、4h组和5h组(高温干预时间)。免疫荧光检测α-actinin标记的H9C2细胞的细胞形态结构;CCK-8检测不同高温干预时长时的细胞活力。(3)Control组,0h组,3h组,6h组和12h组(高温干预后恢复的时间)。Western blotting检测H9C2细胞中TLR4的表达水平。(4)Control组,HS组(43℃高温干预2h后37℃恢复3h)。RT-q PCR和Western blotting检测H9C2细胞中TLR4、NF-κB、p53、SLC7A11和GPX4 mRNA及蛋白的表达水平;ELISA检测H9C2细胞中TNF-α、IL-6及IL-1β含量。(5)Control组、Liproxstatin-1组、HS组和HS+Liproxstatin-1组。Western blotting检测H9C2细胞中SLC7A11和GPX4的表达水平;试剂盒检测H9C2细胞中GSH和MDA含量。(6)Control组、Liproxstatin-1组、HS组、HS+Liproxstatin-1组和Erastin组。透射电镜检测H9C2细胞中线粒体的形态结构;试剂盒检测H9C2细胞中ROS和Fe~(2+)含量。(7)Control组、TAK-242组、HS组和HS+TAK-242组。RT-q PCR及Western blotting和免疫荧光检测H9C2细胞中TLR4、NF-κB、p53、SLC7A11和GPX4 mRNA及蛋白的表达水平;ELISA检测H9C2细胞中TNF-α、IL-6和IL-1β含量;试剂盒检测H9C2细胞GSH、MDA、ROS和Fe~(2+)含量;透射电镜检测H9C2细胞中线粒体形态结构。(8)Control组、PDTC组、HS组、HS+PDTC组和HS+TAK-242组。RT-q PCR检测TLR4、NF-κB、p53、SLC7A11和GPX4 mRNA表达水平;ELISA检测H9C2细胞中TNF-α、IL-6和IL-1β含量;试剂盒检测H9C2细胞GSH、MDA、ROS和Fe~(2+)含量。结果(1)Control组H9C2细胞呈长梭形;与Control组相比,41℃时,细胞骨架开始出现皱缩;43℃时,H9C2细胞逐渐呈不规则形;45℃时,H9C2细胞呈不规则球囊状。CCK-8结果显示,在一定时间内,随着干预温度的增加细胞活力逐渐降低,且在43℃和45℃时细胞活力显著降低(P<0.01)。(2)与Control组相比,在一定温度下,随着干预时间的增加,细胞形态逐渐开始变化,由长梭形逐渐变为不规则椭圆形,且细胞活力逐渐降低(P<0.01)。(3)与Control组相比,TLR4在高温干预后恢复3h时表达显著增高(P<0.01),在6h和12h时TLR4的高表达有所恢复(P<0.05)。RT-q PCR及Western blotting检测结果显示,与Control组相比,HS组TLR4、NF-κB和p53 mRNA及蛋白表达水平显著增加(P<0.01)。与Control组相比,HS组H9C2细胞中TNF-α、IL-6和IL-1β含量显著增加;(4)Western blotting检测结果显示,与Control组相比,HS组SLC7A11和GPX4表达显著增加减少;与Control组相比,Liproxstatin-1组SLC7A11和GPX4蛋白表达无显著性差异(P>0.05),HS组SLC7A11(P<0.01)和GPX4(P<0.05)蛋白表达显著减少;HS+Liproxstatin-1组与HS组相比SLC7A11和GPX4蛋白表达增加(P<0.05)。与Control组相比,Liproxstatin-1组GSH和MDA含量无显著性差异(P>0.05),HS组H9C2细胞中GSH含量明显减少(P<0.01),MDA含量显著增多(P<0.05);HS+Liproxstatin-1组与HS组相比,GSH含量增加(P<0.01)和MDA(P<0.05)含量减少。(5)与Control组相比,Liproxstatin-1组ROS和Fe~(2+)含量无显著性差异,HS组ROS和Fe~(2+)含量显著增多,Erastin组结果与HS组一致;HS+Liproxstatin-1组与HS组相比,ROS和Fe~(2+)含量减少。与Control组相比,Liproxstatin-1组线粒体无明显改变,HS组线粒体变小,线粒体膜密度增高,Erastin组线粒体的变化同HS组一致;HS+Liproxstatin-1组线粒体的形态结构较HS组得到改善。(6)与Control组相比,TAK-242组TLR4、NF-κB、p53、SLC7A11和GPX4 mRNA及蛋白表达无显著性差异(P>0.05),HS组TLR4、NF-κB和p53 mRNA及蛋白表达显著增加(P<0.01),SLC7A11(P<0.05)和GPX4(P<0.01)mRNA及蛋白表达显著减少;与HS组相比,HS+TAK-242组TLR4(P<0.05)、NF-κB(P<0.05)和p53(P<0.01)mRNA及蛋白的表达减少,SLC7A11(P<0.05)和GPX4(P<0.01)的表达增加。与Control组相比,TAK-242组TNF-α、IL-6和IL-1β含量无显著性差异(P>0.05),HS组TNF-α、IL-6和IL-1β含量显著增加(P<0.001);与HS组相比,HS+TAK-242组TNF-α、IL-6和IL-1β含量明显减少(P<0.01)。与Control组相比,TAK-242组线粒体无明显改变,HS组线粒体变小,膜的密度增高;与HS组相比,HS+TAK-242组线粒体的形态结构较改善;与Control组相比,TAK-242组GSH、MDA、ROS和Fe~(2+)含量无显著性差异(P>0.05),HS组GSH含量明显减少(P<0.01),MDA、ROS和Fe~(2+)含量显著增多(P<0.01);HS+TAK-242组与HS组相比GSH(P<0.05)含量增加,MDA(P<0.01)、ROS和Fe~(2+)含量减少。(7)与Control组相比,PDTC组TLR4、NF-κB、p53、SLC7A11和GPX4 mRNA表达无显著性差异(P>0.05),HS组TLR4(P<0.05)、NF-κB(P<0.01)和p53(P<0.01)mRNA表达显著增加,SLC7A11和GPX4 mRNA表达显著减少(P<0.01);与HS组相比,与HS组相比,HS+PDTC组TLR4 mRNA表达无显著性差异,NF-κB和p53 mRNA表达减少,SLC7A11和GPX4mRNA表达增加(P<0.01),HS+TAK-242组TLR4(P<0.05)、NF-κB(P<0.01)和p53(P<0.01)mRNA表达水平减少,SLC7A11(P<0.05)和GPX4(P<0.05)mRNA表达水平增加;与Control组相比,PDTC组TNF-α、IL-6和IL-1β含量无显著性差异(P>0.05),HS组TNF-α、IL-6和IL-1β含量显著增加(P<0.001);与HS组相比,HS+PDTC组TNF-α、IL-6和IL-1β含量降低(P<0.01);HS+TAK-242组H9C2细胞对TNF-α、IL-6和IL-1β含量的影响与HS+PDTC组保持一致;与Control组相比,PDTC组GSH、MDA、ROS和Fe~(2+)含量无显著性差异(P>0.05),HS组GSH含量明显减少,MDA、ROS和Fe~(2+)含量显著增多(P<0.01);与chronic-infection interactionHS组相比,HS+PDTC组GSH含量增加,MDA、ROS和Fe~(2+)含量减少(P<0.01),HS+TAK-2selleck激酶抑制剂42组结果与HS+PDTC组保持一致(P<0.05)。结论高温干预可使大鼠心肌细胞形态异常且细胞活力下降;铁死亡抑制剂干预可改善高温干预导致的心肌细胞铁死亡;抑制TLR4/NF-κB信号通路可改善大鼠心肌细胞炎性环境及铁死亡,提示高温干预导致的心肌细胞损伤机制可能与TLR4/NF-κB炎性信号通路及p53/SLC7A11/GPX4铁死亡信号通路相关。