【目的】结肠癌发病率位居世界第三,已发结肠癌患者以手术切除原发或转移病灶,辅以5氟尿嘧啶/卡培他滨与奥沙利铂联合化疗方案作为主要的临床治疗手段。长期化疗毒性累及和化疗抵抗难以维持疗效,化疗耐药是难治性结肠癌患者高死亡率的主要原因,转移患者5年生存率仅有12%。积极探寻抵抗化疗耐药的分子机制或干预方法是提高化疗水平的重要策略。通过预实验发现,中药来源小分子化合物薯蓣皂苷(Dioscin,DIO)对多种结肠癌细胞具有抑制作用。本研究将继续探索薯蓣皂苷在结肠癌中化疗增敏活性,以期为结肠癌传统化疗方案增敏剂研发提供实验室数据。【方法】1、薯蓣皂苷对结肠癌细胞的化疗增敏作用人原位结肠癌细胞株HCT116、人淋巴转移结肠癌细胞株SW620,复苏、培养至对数期,铺板。DIO、5氟尿嘧啶(5-Fluorouracil,5-Fu)、奥沙利铂(Oxaliplatin,L-OHP)浓度梯度处理细胞24-48h,MTT检测并计算半抑制浓度(Half maximal inhibitory concentration,IC50)。根据IC50,5-Fu、L-OHP(6.4μM、12.8μM)联合DIO(0.4-3.6μM)共处理细胞24h,MTT法检测及计算联合用药指数。分组5-Fu、L-OHP(6.4μM)单独或联合DIO(0.8μM)处理细胞24h,检测细胞增殖、凋亡、周期、侵袭迁移能力,并通过蛋白印迹(Western blotting,WB)检测相关表型及Notch通路蛋白。构建裸鼠移植瘤模型,L-OHP单独或联合DIO给药小鼠,观察药物对移植瘤的生长抑制作用,绘制生长曲线,取眼外周血行肝功能检测,评估药物肝毒性。2、薯蓣皂苷在结肠癌中化疗增敏作用靶点研究以HCT116为主要实验细胞,分组:HCT116-0、HCT116-DIO 0.8μM、HCT116-L-OHP 6.4μM、HCT116-DIO 0.8μM+L-OHP 6.4μM处理细胞24h,送转录组测序(RNA sequencing,RNA-seq)。相关数据库挖掘DIO及结肠癌疾病靶点与测序分析差异基因共交集,为候选交集基因。对候选交集基因进行功能富集分析,构建蛋白质-蛋白质相互作用网络(Protein-protein interaction,PPI)。基于TCGA数据库继续挖掘结肠癌数据集,筛选肿瘤组与非肿瘤组的差异表达基因并与候选交集基因在交集,分析得DIO的潜在活性靶点。对潜在活性靶点进行临床相关性、化疗药物敏感性分析。对潜在活性靶点转录因子(Transcription fators,TF)进行预测,构建潜在活性靶点基因-TF调控网络并进行分子对接实验。最后以实时荧光定量PCR(Real-time Quantitativepolymerase chain reaction,RT-qPCR)、WB进行细胞验证。3、薯蓣皂苷作用ABCA1调控结肠癌化疗增敏机制研究RT-qPCR检查ABCA1在多株结肠癌PEG300细胞中的mRNA表达量,选择HCT116、SW620继续后续实验。分组实验:对照组、DIO 0.8μM、DIO 0.8μM+si-NC、DIO0.8μM+si-ABCA1,WB检测凋亡、周期、通路相关蛋白的表达量,MTT检测细胞增殖,证实DIO通过ANational Biomechanics DayBCA1调控Notch通路发挥抑癌作用。其次,为进一步阐明DIO在结肠癌中化疗增敏作用,构建SW620-5Fu耐药细胞株并鉴定。分组处理耐药株,WB检测通路蛋白Notch1、Hes1和耐药蛋白ABCC1、P-gp表达量,进一步阐述DIO通过ABCA1作用结肠癌的增敏机制。最后,利用裸鼠移植瘤药物治疗后肿瘤组织进行免疫组化实验(Immunohistochemistry,IHC),分析Ki-67、Notch1、ABCA1相关性。【结果】1、DIO协同5-Fu、L-OHP对结肠癌细胞的增敏作用DIO、5-Fu、L-OHP药物对HCT116、SW620的活性抑制与药物浓度及时间梯度正相关。IC50统计结果:DIO的IC50浓度最小,L-OHP、5-Fu分别容易诱导HCT116、SW620耐药。化疗药物单独或联合DIO作用细胞24h,双药联合显著抑制细胞增殖,作用依赖DIO的浓度梯度,联合用药指数CI<1。细胞表型验证,双药组较单药组能显著抑制细胞增殖,通过诱导细胞凋亡、GO/G1周期阻滞,抵抗细胞侵袭、迁移发挥作用。Notch信号通路是一条与结肠癌发病机制正相关的关键调节性耐药途径。Notch1、Hes1蛋白表达量与DIO浓度梯度负性相关。双药联合可逆转L-OHP在HCT116中Notch1的异常激活,并显著降低Hes1蛋白表达量,DIO可以通过Notch途径提高化疗敏感性。体内实验表明,L-OHP联合DIO给药比L-OHP常规给药方式更能有效抑制移植瘤生长,表现低毒性,提示其在临床环境中的应用潜力。2、DIO作用结肠癌细胞活性靶点预测通过数据库挖掘与转录组测序数据交集分析,获得DIO-结肠癌靶点交集基因共31个(候选交集基因)。候选交集基因的GO富集分析,大部分与细胞周期和凋亡调控相关。KEGG富集结果与p53信号通路、铂类药物耐药性、细胞周期、细胞凋亡等代谢和信号转导途径具有显著相关性。候选交集基因进行蛋白质互作网络构建,与TCGA-COAD数据集交集、分析,最终得到DIO在结肠癌相关的差异表达基因共5个(潜在活性靶点)。上调表达的基因有细胞死亡受体(FAS)、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A(Cyclin dependent kinase inhibitor1A,CDKN1A/P21)、ATP结合盒转运蛋白A1(ATP binding cassette transporter A1,ABCA1)、过氧化物酶体增殖物激活受体α(peroxisome proliferators-activated receptorsα,PPARα/PPARA)共4个。下调表达基因1个,周期蛋白依赖性激酶1(FUT-175使用方法cyclin-dependent kinases,CDK1)。临床信息分析显示,癌组织中FAS、CDKN1A、ABCA1、PPARA表达量低于癌旁组织,CDK1表达量高于癌旁组织。化疗药物敏感性分析发现:潜在活性靶点与较多药物存在显著相关性。细胞实验证实,DIO可通过5个潜在活性靶点作用结肠癌细胞,其表达趋势与预测相同,作用强度与DIO浓度相关。3、DIO通过ABCA1调控Notch信号通路作用结肠癌化疗增敏RT-qPCR检查多株结肠癌细胞株和正常结肠上皮细胞,ABCA1在结肠癌中低表达。ABCA1敲降,逆转了DIO对HCT116、SW620的增殖抑制、凋亡诱导及周期阻滞作用,逆转了DIO对Notch通路的抑制作用。构建SW620-5Fu耐药细胞株,细胞形态由“鹅卵石形”向“梭形”改变,耐药蛋白ABCC1、P-gp高表达。敲降ABCA1耐药细胞株,DIO 0.8μM处理,DIO对Notch通路和耐药蛋白的抑制作用被逆转。结果提示:DIO通过ABCA1抑制HCT116、SW620的增殖并促进传统化疗药物增敏,这一过程受Notch信号通路调控。裸鼠移植瘤IHC结果,Ki-67在L-OHP治疗后无统计学差异,提示药物对肿瘤增殖抑制性较弱。DIO协同L-OHP与对照组比较,Ki-67、Notch1表达量逐渐降低,ABCA1的表达量逐渐升高。体内实验与细胞实验结果一致。【结论】1、薯蓣皂苷通过诱导细胞凋亡及周期阻滞、抑制细胞侵袭及迁移,抑制结肠癌细胞增殖,增强奥沙利铂、5氟尿嘧啶对结肠癌细胞化疗敏感。2、薯蓣皂苷通过抑制Notch信号通路,发挥其抗癌作用。3、转录组分析联合高通量药物信息学分析,FAS、CDKN1A、ABCA1、PPARA、CDK1可作为薯蓣皂苷在结肠癌中的潜在活性靶点被关注。4、薯蓣皂苷通过ABCA1调控Notch通路抑制结肠癌细胞增殖并参与结肠癌细胞的化疗增敏作用。