乳果糖是一种具有强效益生元特性的非消化性二糖,广泛应用于健康食品和临床医药领域。基于生物催化剂合成乳果糖被认为是更绿色、安全且高效的路径。目前,来源于Caldicellulosiruptor saccharolyticus的纤维二糖差向异构酶(Cs CE)被认为是最具应用前景的乳果糖制备酶,但是存在结构异构活性较低、底物亲和力差以及副产物依匹乳糖的积累等制约因素。分子改造是改善酶催化性能的有效策略,本研究致力于探索影响结构异构活性的关键作用区域,通过半理性设计对酶的柔性环及底物结合位点进行改造,增强Cs CE对底物乳糖的结构异构活性及底物亲和力,从而提高乳果糖的转化率;基于酶学研究基础,构建大肠杆菌多酶级联催化细胞工厂,探究其在乳清粉增值研究中的应用,推动生物法制备乳果糖的工业化应用进程。主要研究内容和结论如下:首先,针对Cs CE结构异构活性差、影响酶催化方向的关键作用域不清晰的问题,对具有不同催化方向的N-acyl-D-glucosamine 2-epimerase(AGE)家族酶进行序列及晶体结构对比,发掘影响结构异构及差向异构催化方向的关键区域,并通过分子改造进行验证。根据AGE家族酶的晶体结构比对发现,它们拥有相同的(α/α)_6基本桶状结构,但是位于A、B两处的柔性环的长度和形状存在较大差异,结合AGE家族酶的底物特异性及催化机制等信息进一步提出了“柔性环所处的位置(A或B)及形状影响其催化方向”的猜想。为验证GW-572016 molecular weight该猜想,以Cs CE和来源于Marinomonas mediterranead的甘露糖结构异构酶(Mm MI)为改造模板,选取A/B柔性环形状差异较大的位置进MCC950配制行替换,成功构建了Cs-AS、Cs-AS+BL、Cs-BL、Cs-AP、Mm-BS、Mm-BS+AL和Mm-AL共7个突变体,并探究了突变体的催化方向。结果表明,具有双催化方向的Cs CE的A柔性环显著影响其结构异构活性,而对差向异构活性影响较小;具有单催化方向的Mm MI的B柔性环的存在与否直接影响其结构异构催化活性。由此可以得出结论,AGE家族酶的柔性环所处位置、长度及形状与酶的催化方向密切相关。基于上述发现,探究了A柔性环改造对Cs CE催化活性的影响。通过柔性环交换的方法将Cs CE柔性环中靠近底物非还原端的部分(“下端”)替换成来源于Bacillus thermoamylovorans(Bt CE)、Rhodothermus marinus(Rm CE)、Ruminococcus albus(Ra CE)和Spirochaeta thermophila(St CE)的CE柔性环的相应区段,分别构建了四个基于Cs CE的柔性环突变体:Bt C、Rm C、Ra C和St C。相较于野生型Cs CE,重组酶Rm C的结构异构活性增加了2.2倍,且催化效率增加了1.34倍。分子动力学模拟结果表明,Rm C柔性环更加远离活性中心,具有更大的底物入口,有利于底物进入和稳定酶-底物构象。以上结果证实活性中心入口处的A柔性环的形状和组成是影响酶催化活性的关键因素,可以通过影响底物结合和质子转移来调控酶的催化活性。Cs CE对于底物乳糖的亲和力较差(K_m,417.5 m M)导致酶催化效率低。鉴于柔性环改造可以促进酶与底物非还原端之间的相互作用,进一步推测底物非还原端的结合作用可能直接影响酶的底物亲和力,采用半理性设计策略对Cs CE底物结合位点进行了重塑。由酶-配体复合物的晶体结构得知Cs CE/W308和Cs CE/W372分别位于底物的还原端和非还原端的吡喃环侧MEM modified Eagle’s medium,其中Cs CE/W308在整个AGE家族酶序列中保守,而Cs CE/W372仅在CE酶序列中保守。通过对Cs CE/W372位点的饱和突变证实了该残基负责识别二糖非还原端并形成π-π相互作用,有助于底物的稳定性和正确构象。进而将底物结合区域划分为三个亚区:区域A,与底物还原端相互作用的底物结合亚区(包括残基I306和W307);区域B,与底物的非还原端相互作用的底物结合亚区(残基Q371);区域C,活性中心入口亚区(残基W355)。通过对底物结合位点的饱和突变获得了结构异构活性增强3.3倍、催化效率提高1.53倍且底物亲和力显著改善的突变体Cs CE/Q371E(K_m值由417.5 m M降低至269.65 m M),同时乳果糖的转化率由60%提升至72%。分子动力学模拟发现,Cs CE/Q371E活性中心具有丰富的氢键网络使底物构象更加稳定;催化残基His188和底物之间相互作用力的增强有助于提高结构异构化方活性;此外,Q371E的突变改变了催化残基His377和C2/O1原子之间距离,促使催化向结构异构化方向进行。以上研究表明底物结合位点的重塑可显著改善酶与底物的亲和力,最终提高乳果糖产量。由于单酶催化体系存在副产物依匹乳糖、酶纯化成本高、需要高温反应(75℃)等缺陷,通过构建双酶级联催化细胞工厂解除限制,并将其进一步应用于乳清粉生物催化制备乳果糖的研究中。首先,在CE催化体系中引入具有将依匹乳糖转化成乳果糖的结构异构酶(MI),构建CE-MI双酶级联体系,级联体系促进了副产物依匹乳糖的转化,将乳果糖产量由3.55 g/L提高至4.0 g/L;针对CE与MI分别进行分子改良,成功获得乳果糖产量提高43%的Mm MI突变体(F242N);将优化升级后的催化模块Cs CE/Q371E与Mm MI/F242N构建于p ET28b质粒载体上,并通过RBS策略调节两酶表达量,最终获得了乳果糖最高产量的共表达菌株:E.coli p ET28b-_(T7)-_(RBSW)-Cs CE/Q371E-_(T7)-_(RBS29)-Mm MI/F242N。将该细胞工厂应用于乳清粉的增值利用研究中,乳果糖转化率达到91.3%,且副产物依匹乳糖产量下降至3.5%,显著优于单酶发酵体系(乳果糖,63%;依匹乳糖,12%)。上述研究结果表明,构建的大肠杆菌双酶级联细胞工厂能够促进副产物依匹乳糖转化成目标产物乳果糖,且无需酶的分离纯化,在制备高产量及高纯度乳果糖方面具有良好的应用潜力。