右旋糖酐是一种以葡萄糖为单元,通过α-1,6键相连而成的同多糖,因其具有独特的物理、化学性质,在食品、医药和材料等领域均有广泛的应用。目前传统的右旋糖酐制备方法包括微生物发酵法和酶法,两者均直接或间接地由葡聚糖蔗糖酶转化蔗糖底物合成右旋糖酐,由于该酶仅利用到蔗糖中的葡萄糖单元,其最高理论转化率仅有47.3%。本研究提出一种利用淀粉制备右旋糖酐的多酶复配工艺,通过4,6-α-葡聚糖转移酶(4,6-α-GT)、普鲁兰酶(PUL)和异普鲁兰酶(IPU)协同作用,可利用淀粉类底物合成无分支修饰的高纯度右旋糖酐。主要研究结果如下:(1)制备右旋糖酐的多酶协同体系建立。以研究报道最多的Limosilactobacillus reuteri 121来源的Gtf B(命名为Lr Gtf B)为4,6-α-GT研究对象,通过单独使用Lr Gtf B、Lr Gtf B与PUL复配以及Lr Gtf B、PUL与PUL三酶复配作用在淀粉底物,阐明各种酶在工艺中的作用。其中,PUL通过水解淀粉分支处的α-1,6键,可将支链淀粉结构转化为直链型底物。在与PUL复配的基础上,Lr Gtf B以直链淀粉为底物,通过α-1,6转苷反应合成富含α-1,6键的线型异麦芽/麦芽多糖产物(IMMP),经过糖化酶消化后α-1,6键比例达90.6%。IPU则通过水解IMMP中紧挨着异麦芽多糖并向还原端延伸的α-1,4键,使IMMP转化为非还原端含有少量连续α-1,4键的右旋糖酐。最后经过糖化酶消化得到右旋糖酐,α-1,6键比例达100%。(2)多酶协同制备右旋糖酐的工艺优化及影响右旋糖酐分子量的因素探究。为制备不同分子量右旋糖酐并探究影响其分子量的因素,选择Lr Gtf B与实验室前期鉴定表达的Bacillus sporothermodurans和LimSB203580osilactobacillus fermentum NCC 3057来源的两个4,6-α-GT(分sports & exercise medicine别命名为Lf Gtf B和Bs Gtf C)分别参与复配工艺,所得右旋糖酐分子量为5.6 k Da、3.5 k Da和1.3 k Da。分别对其参与工艺的反应条件进行优化,结果显示DE2麦芽糊精底物最佳浓度均为200 g·L~(-1),PUL和IPU的最佳加量分别为40 U·g~(-1)和50 U·g~(-1)。复配反应的最适p H均为5.0,最适反应温度分别为35℃、40℃和40℃,最适加酶量分别为300 U·g~(-1)、300 U·g~(-1)和800 U·g~(-1),糖化酶添加量为1000 U·g~(-1),消化时间为20 min,最终右旋糖酐产率分别可达79.2%、78.2%和72.2%。以不同淀粉和麦芽糊精为底物时,可得分子量3 k Da-20 k Da的右旋糖酐,其分子量随直链淀粉含量增加而增加,随麦芽糊精的液化程度增加而减小。此外,在工艺中添加麦芽糖和异麦芽糖会使得产物聚合度减小。(3)4,6-α-GT酶与右旋糖酐分子量的构效关系初步研究。通过LrGtf B和Lf Gtf B、Bs Gtf C和Lr Gtf B及不同来源的Gtf C的对比分析,设计并构建突变体进行右旋糖酐制备实验。结果表明,Lf Gtf B中+1亚位点上方的loop区域突变S346T、S348V及S346T/S348V能提高其产物聚合度,Lr Gtf B中与上述对应位置的突变T920V也可显著提高产物聚合度。Bs Gtf C中位于+1位点的突变体H416N可显著提高其产物聚合度,而Lr Gtf B中相应位点的突变N1019H可显著降低其产物聚合度。BsGtfC中的+3亚位点突变Y467WJQ1浓度可显著提高其产物聚合度。(4)右旋糖酐的应用效果评价。对BsGtf C参与制备的小分子右旋糖酐(SDex)益生效果评价,与商品右旋糖酐20、商品低聚异麦芽糖及空白对照相比,SDex可以显著促进双歧杆菌、乳杆菌等益生菌的增殖,并促进产更多乙酸。同时不会促进条件致病菌大肠杆菌的生长,具有选择性益生的功能。以Lr Gtf B参与制备的右旋糖酐为原料制备右旋糖酐铁。采用截留分子量3 k Da的超滤膜进行纯化,获得重均分子量为5895,分布系数1.51的右旋糖酐,使用该右旋糖酐制备右旋糖酐铁,铁含量可达35.6%,远高于药典要求的25%。