背景与目的:胆管癌(Cholangiocarcinoma,CCA)起源于胆管上皮,约占所有胃肠道肿瘤的3%,作为肝胆系统第二常见的恶性疾病,在全球近几十年内的发病率呈现持续增加态势~([1])。因其起病隐匿,侵袭性强,手术切除率低,患者总体预后较差,5年生存率仅5%-15%~([1])。ABC-02研究已经证实,对于无法行手术切除的CCA患者,吉西他滨(Gemcitabin,GEM)联合顺铂(Cisplatin,DDP)优于GEM单药,并被美国国立综合癌症网络(National Comprehensive Cancer Network,NCCN)指南列为晚期CCA的标准化疗方案~([2]),一线治疗后,积极控制症状联合FOLFOX方案~([3])也能够为晚期胆道恶性肿瘤患者提供生存改善。虽然已有证据显示,胆管癌存在不同程度的基因突变,例如IDH1突变、BRAFV600E突变、NTRK融合和/或HER2(ERBB2)扩增~([4]),但基于以上靶点药物的多项临床试验研究均未显示出优于基础化疗方案的结果。2020年4月17日,美国食品药品管理局(Food and Drugplant immunity Administration,FDA)加速批准培米替尼片上市~([5]),然而发生FGFR融合/重排的患者不足CCA患者的五分之一~([6]);且由于患者总生存率尚未达到随访终点,仍缺乏亚洲人群其是中国患者相关疗效数据。近期TOPAZ-1的突破性研究~([7]),使得化疗联合免疫治疗(度伐利尤单抗,Durvalumab)的方案有望列入胆道恶性肿瘤诊疗指南的一线治疗方案,不可忽略的是,传统化疗仍然是CCA的重要治疗手段。白藜芦RP56976半抑制浓度醇(resveratrol,trans-3,4’,5,-trihydroxystilbene,Res)最早从白木香的根中分离得到~([8]),作为一种天然存在的多酚类化合物,基于前期对白藜芦醇的实验和临床试验以及白藜芦醇的分子特性,白藜芦醇可能应用于以下治疗策略:首先,由于白藜芦醇具有抑制癌细胞增殖和诱导细胞凋亡的能力,白藜芦醇可作为术前新辅助化疗药物以减小肿瘤体积;其次,白藜芦醇可以作为一种辅助化疗药物抑制癌症术后的早期侵袭和转移;第三,白藜芦醇可以作为放疗或化疗增敏剂与多种化疗药物联用可能提高其抗癌效果;第四,白藜芦醇可用于癌症高危人群的癌症预防;第五,白藜芦醇可以作为一种辐射保护剂来减少放疗引起的不良反应,包括口干症和黏膜炎~([9])。鉴于已有研究发现白藜芦醇在对抗癌症耐药性方面具有增益作用,可以增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。由于白藜芦醇的抗氧化及舒张血管等特性,能进一步缓解基础化疗带来的副作用,减轻化疗对正常细胞的杀伤作用,因此具有很大的研究前景及应用价值。综上所述,吉西他滨联合顺铂的标准化疗方案在胆管癌化学药物治疗方面依然并且在可见的未来仍将具有极其重要的地位,如何提高胆管癌患者对GP治疗的敏感性,寻找更佳的联合治疗方案具有积极意义和潜在的临床应用价值。鉴于白藜芦醇对抗肿瘤的特性,白藜芦醇联合GP的三联方案能否优于传统的化疗方案,值得进一步探索。研究方法:白藜芦醇增强胆管癌细胞对吉西他滨联合顺铂的化疗敏感性1)选取胆管癌细胞系并通过cck8实验对白藜芦醇,吉西他滨及顺铂的起效浓度进行摸索以开展后续体外实验;2)通过克隆形成、侵袭及迁移实验、流式凋亡分析等表型实验探究白藜芦醇对胆管癌细胞的增殖,凋亡能力的影响;3)通过Western blot等手段检测自噬凋亡等相关标志物的表达,ROS探针检测细胞的活性氧状态;4)建立裸鼠皮下荷瘤模型,处死后第一时间对瘤重,体积,大小等进行记录。白藜芦醇减轻吉西他滨联合顺铂化疗的毒副作用研究1)选取C57小黑鼠,2周后待瘤体长到合适大小进行分组用药(分为NC/吉西他滨+顺铂/吉西他滨+顺铂+白藜芦醇三组),1周后处死,处死后第一时间抽取老鼠鼠骨髓并进行骨髓涂片制作及染色镜检等操作;并将小鼠的脾脏进行剥离,摆放好标尺拍照。2)征集健康志愿者,抽取其外周血,提取外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)后分组用药置于37℃二氧化碳孵箱培养36h,并采用ELISA法检测白介素1β,3,TNF-α的浓度。白藜芦醇协同吉西他滨联合顺铂化疗疗效作用机制研究1)将分组用药培养的胆管癌细胞系进行RNA-Seq研究以进行有效靶点CYP24A1,VDR,Rx Rα的寻找;2)通过RT-PCR,Western blot验证CYP24A1,VDR,Rx Rα在不同分组用药细胞中的表达情selleck况;3)添加VDR抑制剂骨化二醇,通过RT-q PCR,Western blot验证CYP24A1,VDR,Rx Rα在不同分组用药细胞中的表达情况;4)将前述裸鼠皮下荷瘤模型鼠瘤进行免疫组化染色以验证CYP24A1,VDR,Rx Rα的表达情况;5)收集不同用药分组细胞的上清,采用试剂盒法对上清进行外泌体抽提并做好标记;6)对VDR阳性的外泌体进行分选并富集,后添加进细胞培养基中并对细胞系进行培养,通过EDU及流式凋亡分析等实验进行增殖及凋亡能力检测;7)通过生信网站(GEPIA2等)预测VDR对CCA患者预后的影响;8)通过对人ICC芯片就VDR,Rx Rα进行免疫组化染色并与患者临床信息相匹配,探究VDR表达与预后的关系。研究结果:1)CCK8实验表明胆管癌细胞系RBE及HCCC-9810的最适起效浓度为白藜芦醇1μM,吉西他滨联合顺铂为10μM;2)克隆形成、EDU、流式凋亡分析均表明,相较于吉西他滨+顺铂组,白藜芦醇的加入增强了肿瘤细胞的杀伤作用,进而导致增殖能力减弱及凋亡(早凋+晚凋)比例增加;3)Western blot等实验表明,白藜芦醇能够通过进一步增强凋亡及自噬相关标记物的表达来促进肿瘤细胞的死亡;4)裸鼠成瘤实验表明,相较于NC组小鼠,吉西他滨联合顺铂治疗组的小鼠的皮下荷瘤较小,白藜芦醇联合治疗组小鼠的皮下荷瘤最小,且在瘤重方面也展现出同样的趋势;5)小鼠骨髓涂片显示,相较于NC组小鼠吉西他滨联合顺铂用药组小鼠的骨髓抑制作用明显,白藜芦醇联合治疗组小鼠的骨髓抑制效应较吉西他滨联合顺铂用药组小鼠得到缓减;6)健康志愿者PBMC用药培养后的细胞上清细胞因子检测显示,白介素1β,3,TNF-α等细胞因子的浓度在NC/吉西他滨+顺铂/吉西他滨+顺铂+白藜芦醇三组中呈现递进式增加;7)RNA-Seq结果显示吉西他滨联合顺铂处理后CYP24A1的表达量显著下降,白藜芦醇的加入能够使得这一趋势更加明显,此种趋势在湿实验中得到证实,且VDR,Rx Rα的表达趋势在各组间与CYP24A1相反;8)VDR抑制剂骨化二醇的加入能够逆转结果7)的趋势,VDR抑制剂的加入使得白藜芦醇增强吉西他滨联合顺铂治疗的敏感性降低。9)裸鼠皮下荷瘤模型鼠瘤免疫组化结果显示CYP24A1,VDR,Rx Rα的表达与前述湿实验结果展现出同等趋势;10)外泌体研究显示,VDR~+外泌体治疗能够明显抑制癌细胞的增殖同时能够促进癌细胞的凋亡,因此VDR~+外泌体能够增强吉西他滨联合顺铂治疗的药物敏感性;11)生信网站(GEPIA2等)预测结果显示,VDR的表达与CCA患者的预后呈现正相关,且根据CCA组织芯片VDR结果所建立的预后关系展示出了与生信预测相一致的结果。实验结论:我们的研究发现,白藜芦醇的加入能够增强吉西他滨联合顺铂治疗胆管癌细胞的药物敏感性,同时,白藜芦醇能够减轻吉西他滨联合顺铂治疗的骨髓毒性。白藜芦醇通过抑制CYP24A1的表达增强VDR活性以提高CCA对药物的敏感性,且VDR~+外泌体能够展现出同样的抗癌增敏效果,VDR是与CCA化疗敏感性相关的关键效应分子,增强VDR的表达能够抑制CCA细胞的增殖并促进其凋亡。