目的:乳腺癌是女性群体中最常见的恶性肿瘤。现阶段,治疗乳腺癌的手段包括手术治疗、内分泌治疗、放疗和化疗等。化疗药物在整个乳腺癌治疗过程中扮演了重要角色。但是由于化疗药物的耐药和高毒副作用,新的治疗药物的研发迫在眉睫。天然产物是新药的重要来源,莪术醇是从传统中药莪术中提取的天然小分子化合物,具有显著的抗肿瘤活性。但是由于其结构的特殊性,使它存在低溶解性和低生物利用度的问题。本课题组前期以莪术醇作为母核对其进行结构修饰,得到了一系列莪术醇衍生物,试图提高其抗癌活性以及改善溶解性。本研究旨在从这一系列莪术醇衍生物中筛选出具有抗乳腺癌活性的衍生物,并研究其抗乳腺癌作用及分子机制。以期为后续乳腺癌的治疗提供初步的物质基础,并为传统中药莪术的综合利用与开发提供理论依据。方法:(1)通过MTT法从一系列莪术醇衍生物中筛选出具有抗乳腺癌活性确认细节的化合物,并检测不同浓度的活性化合物对乳腺癌细胞活力的影响以及不同浓度的化合物在不同时间点对细胞生长的影响并绘制生长曲线;平板克隆实验检测活性化合物对细胞增殖的影响;(2)用划痕愈伤实验及Transwell实验检测活性化合物对MDA-MB-231细胞迁移及侵袭的影响,细胞黏附实验检测活性化合物对细胞黏附的影响;(3)利用RNA-seq技术检测活性化合物作用后,转录谱的变化情况,并利用生物信息学手段对差异表达的基因进行富集分析;(4)利用流式细胞仪检测化合物对乳腺癌细胞的周期、凋亡以及与铁死亡相关的活性氧(Reactive oxygenspecies,ROS)、脂质过氧化和不稳定铁池(labile iron pool,LIP)水平的影响;(5)采用线粒体膜电位试剂盒(JC-1)检测活性化合物对乳腺癌细胞线粒体膜电位(Mitochondrial membrane potential,MMP)的影响;(6)Western blot检测化合物对乳腺癌细胞凋亡和周期相关的关键蛋白的表达情况的变化;(7)利用q RT-PCR和Western blot检测活性化合物处理后,铁死亡相关的关键基因在m RNA和蛋白水平上的表达情况;(8)将鼠源乳腺癌细胞4T1-luc(萤火虫荧光素酶标记)注射入乳腺脂肪垫的小鼠建立小鼠荷瘤模型,在体内检测活性化合物对小鼠乳腺肿瘤增长的影响。结果:(1)编号为HCL-23的莪术醇衍生物对乳腺癌MDA-MB-231细胞展现出较好的抑制作用,其IC_(50)为7.18±0.41μM。HCL-23处理后MDA-MB-231细胞从长梭形向圆形转变,20μM的浓度下有明显的细胞破损,并且能够以浓度依赖的方式抑制MDA-MB-231细胞增殖,及抑制MDA-MB-231细胞的迁移、侵袭和黏附。(2)通过RNA-seq,鉴定出990个HCL-23处理后的差异基因,包括366个上调基因和624个下调基因。对差异基因进行功能富集分析,发现HCL-23可能通过调节铁死亡、凋亡和ECM-受体相互作用发挥抗乳腺癌作用。(3)HCL-23能够诱导细胞凋亡和激活半胱天冬酶(Cysteinyl aspartate specific proteinase,Caspase)级联反应,并且由HCL-23诱导的细胞活力降低可被Caspase泛抑制剂Z-VAD-FMK(Z-VAD)部分逆转。(4)HCL-23能够引起MDA-MB-231细胞的脂质过氧化、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)、LIP和ROS水平升高。此外,铁死亡抑制剂(Ferrostatin-1,Fer-1)能够阻止HCL-23引起的脂质过氧化和LIP的水平升高以及细胞活力下降。去铁胺(Deferoxamine,DFO)能够阻止HCL-23引起的脂质过氧化水平升高和细胞活力下降。这表明HCL-23能够诱导细胞铁死亡。经RNA-seq分析,HCL-23能够显著上调血红素氧合酶1(HMOX1,HO-1)的表达,且在m RNA和蛋白水平上的表达与上述结果一致。敲除HO-1后,可以部分逆转HCL-23引起细胞脂质过氧化和LIP水平升高,以及HCL-23引起的细胞活力降低。这表明,HCV infectionHCL-23诱导细胞发生铁死亡依赖于HO-1的上调。(5)HCL-23可诱导MDA-MB-231细胞周期阻滞在G2/M期,并且下调与细胞周期相关的CDK-1、Cyclin B1和p-Cdc25C的蛋白表达。(6)HCL-23显著抑制了小鼠乳腺肿瘤位置的生物发光和小鼠乳腺肿瘤的生长。Western blot结果显示,与对照组相比,HCL-23治疗组的小鼠乳腺肿瘤中的CleavedPCI-32765-Caspase 3、Cleved-PARP和HO-1的表达显著上调。并且通过免疫组化(Immunohistochemistry,IHC)也发现HO-1在HCL-23治疗组的小鼠瘤组织中高表达。并且通过苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining,HE)观察到HCL-23治疗组小鼠瘤组织的细胞核分裂和核浆比率降低。此外,HCL-23治疗组与对照组相比小鼠的体重无明显变化。并且HE染色结果显示,HCL-23治疗组的小鼠肝脏和肾脏与对照组相比未见明显的病变。结论:本研究从一系列莪术醇衍生物中筛选出具有抗乳腺癌活性的HCL-23。HCL-23能够显著抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖与转移,且这种抑制作用可能是通过激活Caspase介导的凋亡和HO-1依赖的铁死亡实现的。