背景:肺癌死亡率高,约占恶性肿瘤死亡人数的23.8%。奥希替尼作为第三代表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors,EGFR-TKI)的代表,对EGFR敏感突变和T7Tissue biomagnification90M突变均具有不可逆的高度选择性,目前已成为此类患者标准一线治疗及一、二代EGFR-TKI耐药后的首要选择。然而,研究表明,在一线治疗19个月及二线治疗11个月后,奥希替尼出现了继发性耐药。因此,探究奥希替尼继发性耐药机制亟待解决。既往研究显示micro RNA(miRNA)与一代EGFR-TKIs的获得性耐药有关。上调或下调miR-27a、miR-134、miR-34a的表达可显著影响耐药细胞对一代EGFR-TKIs的敏感性。但miRNA是否参与第三代EGFR-TKIs的继发性耐药?目前研究较少。因此本研究首先通过构建奥希替尼继发性耐药细胞株(A549/Osi和H1975/Osi),基于转录组测序探索miRNA在奥希替尼继发性耐药前后的变化,筛选出潜在标志物miR-7704、miR-219a-5p;随后基于体外细胞实验和体内动物实验探索miR-7704、miR-219a-5p参与奥希替尼继发性耐药的分子机制;最后通过监测非小细胞肺癌(Non-Small Cell Lung Carcinoma,NSCLC)患者外周血miR-7704、miR-219a-5p水平的变化,评价其对发生EGFR-TKi继发性耐药的预测价值。方法:1.采用药物浓度递增的方法诱导细胞系A549(EGFR野生型)和细胞系H1975(含有EGFR L858R/T790M突变)建立三代EGFR-TKI奥希替尼耐药株A549/Osi和H1975/Osi。通过细胞毒性实验检测耐药株的耐药指数,鉴定耐药株构建成功;通过显微镜观察耐药株与亲本株的细胞形态差异;通过细胞毒性试验、平板克隆形成实验、划痕实验及Transwell实验分析耐药株与亲本株在增殖、迁移与侵袭能力方面的差异。2.提取耐药株和亲本株的miRNA,检测miRNA质量,构建miRAN文库,进行miRNA测序,采用Deseq2软件分析耐药细胞株与亲本细胞株miRNA的差异表达。统计分析差异表达基因的数量及分布情况,进行GO和KEGG富集分析,找出存在显著差异的miRNA。3.利用miRDB、miRWalk和Target Scan Human8.0三个数据库对差异显著且与肿瘤耐药后临床预后变化一致的miRNA的靶基因进行预测,取三者交集作为候选靶基因集合;利用GEPIA2数据库分析候选靶基因在肺腺癌组织的表达水平以及与患者总体生存的相关性,选择最佳靶基因进行后续验证。通过慢病毒转染耐药细胞株的方法干扰miR-7704和过表达miR-219a-5p,通过细胞毒性试验检测奥希替尼的半抑制浓度(IC50),分析细胞耐药性的变化;通过实时荧光定量聚合酶链反应(RT-QPCR)、蛋白免疫印迹(Western Blot)实验检测干扰miR-7704和过表达miR-219a-5p后靶基因的变化;通过裸鼠皮下荷瘤实验,观察干扰miR-7704和过表达miR-219a-5p后耐药细胞株对奥希替尼药物敏感性的变化。4.设计单中心、前瞻性临床研究,收集符合入组标准的NSCLC患者信息及生物学样本,采用门诊随访和电话随访的形式记录患者疾病状态及生存时间;检测患者外周血miR-7704、miR-219a-5p基线水平和发生耐药后的表达水平。分析外周血miR-7704、miR-219a-5p水平与奥希替尼疗效及患者生存相关性。结果:1.奥希替尼继发性耐药细胞株的构建。利用奥希替尼浓度梯度递增诱导构建A549耐药细胞株A549/Osi和H1975耐药细胞株H1975/Osi,细胞毒性实验显示两组耐药指数分别为23.22和109.21,证明耐药细胞株构建成功;与亲本细胞相比,耐药细胞呈梭形,细胞形状不规则,呈触角状,上皮样细胞形态丧失,细胞质中呈圆形空泡,细胞间隙增多;cck-8结果显示A549/Osi和H1975/Osi耐药细胞均比亲本细胞的增殖能力减弱(P<0.05);划痕实验结果显示两组耐药细胞株在24h和48h的细胞迁移能力增强(P<0.05)Panobinostat NMR;Transwell实验显示两组耐药株的侵袭能力增强(P<0.05);2.基于miRNA筛查奥希替尼继发性耐药的潜在标志物。对两组细胞株miRNA测序分析发现在A549耐药细胞系中,93个miRNA表达上调,94个miRNA表达下调。在H1975耐药细胞系中,124个miRNA表达上调,53个miRNA表达下调。通过GO和KEGG富集分析筛选出两者P值均小于0.05的7个有意义的miRNA,miR-708-5p、miR-708-3p、miR-10395-3p、miR-7704和miR-34a-5p在耐药株显著上调GDC-0973体内,miR-19b-1-5p和miR-219a-5p在耐药株显著下调。3.miR-7704和miR-219a-5p在非小细胞肺癌第三代EGFR-TKI继发性耐药中的作用及机制研究。查阅文献发现七个表达明显差异的miRNA中仅有miR-7704高表达及miR-219a-5p低表达与肿瘤进展有关,这与诱导奥希替尼细胞耐药后肿瘤侵袭力增强一致,因此选择miR-7704与miR-219a-5p进行下一步研究,利用miRDB、miRWalk、Target Scan Human8.0数据库预测miR-7704与miR-219a-5p靶基因分别为GNG7和CXXC5。细胞毒性试验显示干扰miR-7704或过表达miR-219a-5p后耐药株对奥希替尼的耐药指数分别是39.42和30.5,较对照组耐药株耐药指数109.21明显降低:提示下调miR-7704或上调miR-219a-5p均显著减弱奥希替尼耐药性;RT-QPCR和WB结果显示干扰miR-7704后GNG7表达升高;过表达miR-219a-5p后CXXC5表达下降。提示GNG7和CXXC5可能分别是miR-7704和miR-219a-5p的靶基因。进一步的裸鼠皮下荷瘤实验表明,干扰miR-7704组与对照组的肿瘤大小分别为145.95±83.80和283.40±69.99;过表达miR-219a-5p与对照组的肿瘤大小分别为148.89±73.04和397.86±177.81,证明下调miR-7704或上调miR-219a-5p均显著提高奥希替尼药物敏感性;4.外周血miR7704与miR-219a-5p水平对EGFR突变型NSCLC患者的预后价值本研究共入组19例患者,其中1例失访。截止到本研究结束,8例患者发生奥希替尼耐药,10例患者仍持续予奥希替尼治疗中。18例患者外周血清miR-7704、miR-219a-5p的基线水平分别是201.47±77.18和331.03±170.94。miR-7704高水平组与低水平组的耐药发生率分别是66.7%和22.2%(P=0.077),差异无统计学意义:OS分别是16.92±1.09(月)、23.93±2.20(月)(P=0.002),差异有统计学意义;miR-219a-5p高水平组与低水平组的的耐药发生率分别是11.1%和77.8%(P=0.008),差异有统计学意义;OS分别是18.11±1.31(月)、23.77±2.95(月)(P=0.145),差异具有统计学意义。此外,发生继发性耐药的8例患者中,外周血清miR-7704的基线和耐药后水平分别是245.70±80.86和583.88±175.37(p=0.0002),差异具有统计学意义;外周血清miR-219a-5p的基线和耐药后水平分别是368.11±146.13和102.16±38.28(p=0.0002),差异具有统计学意义。结论:本研究发现miR-7704、miR-219a-5p在奥希替尼耐药中发挥关键作用,干预其表达后可降低耐药细胞的耐药性。