胰腺癌是一种死亡率极高的恶性肿瘤。因其早期诊断困难、侵袭性强、远处转移等特点,患者5年生存率不足10%。当前,临床以盐酸吉西他滨为主的单药或联合化疗方案的疗效不佳,并且新癌症疗法如免疫检查点抑制剂疗法、基因疗法等对胰腺癌基本无效。因此,当下急需探索治疗胰腺癌的新策略新方法。铁死亡是一种不同于细胞凋亡rapid biomarker、焦亡、坏死的细胞死亡形式,能对KRAS突变的胰腺癌细胞产生显著的抑制作用。铁死亡能逆转胰腺癌对传统凋亡类化疗药的耐药性,其与传统化疗联合可以产生显著的协同抑制效果。因此,基于铁死亡-化疗的联合治疗策略为传统疗法治疗不佳的胰腺癌提供一种全新的治疗思路。脂质-介孔二氧化硅纳米粒(lipid-coated mesoporous silica nanoparticle,Lip-MSN)是一种将脂质膜包裹到介孔二氧化硅表面形成的纳米粒。作为联合药物递送载体,Lip-MSN不仅具有介孔二氧化硅与脂质体的优点,还克服了两者的缺点。其内核介孔二氧化硅可以作为内部装载区容纳药物分子,并为整体结构提供支撑骨架来稳定外层的脂质膜;外层的脂质膜可以充当脂溶性药物的装载区,并通过包覆在介孔二氧化硅表面实现内部装载药物的可控释放,提高介孔二氧化硅的生物相容性与胶体稳定性,并且更容易进行靶向分子或刺激响应型材料的功能修饰。RGD肽能特异性结合在整合素αvβ3和αvβ5受体上,而胰腺肿瘤细胞表面(如PANC-1细胞等)以及肿瘤基质中过度表达的纤维蛋白原,纤溶酶原,层粘连蛋白等均含有整合素αvβ3和αvβ5受体。因此,RGD肽可作为靶向胰腺癌的重要配体。本课题设计了一种RGD肽修饰的p H响应型脂质-介孔二氧化硅纳米递送系统来同时包载递送铁死亡诱导剂Erastin(Era)与化疗药盐酸吉西他滨(gemcitabine hydrochloride,hcGEM),以期增强协同抗肿瘤效果,减少药物给药剂量并且降低药物的系统毒性。该递送系统不仅能通过表面修饰的RGD肽主动将药物靶向递送至整合素受体高表达的胰腺肿瘤组织,还能在肿瘤酸性微环境内实现协同治疗药物的p H敏感释放,在降低毒副作用的同时提高药物对胰腺癌细胞的杀伤作用。首先,利用CCK8法考察了不同铁死亡诱导剂联合hcGEM对胰腺癌细胞的协同抑制效果,发现三种铁死亡诱导剂均能不同程度地协同抑制PANC-1细胞以及耐hcGEM的PANC-1细胞(PANC-1/hcGEM)。其中,hcGEM-Era 4:1组能在所有浓度下协同抑制PANC-1细胞与PANC-1/hcGEM细胞,故后续以hcGEM与Era为主药进行处方研究。其次,通过高效液相色谱法建立了hcGEM与Era的含量测定方法。结果显示,hcGEM的浓度在2～250μg/m L内,峰面积与浓度呈线性相关(R~2=1),线性回归方程为A=0.4572 C+0.3902;Era的浓度在2～250μg/m L内,峰面积与浓度呈线性相关(R~2=0.9999),线性回归方程为A=0.3352 C+0.0969。经考察验证,两种药物含量测定方法的专属性、标准曲线、精密度以及提取回收率均符合测定要求,可用于hcGEM与Era两种药物的含量测定及体外释放含量测定,为后续处方研究奠定了良好的实验基础。再次,采用溶胶-凝胶法制备了介孔二氧化硅纳米粒(mesoporous silica nanoparticle,MSN),并通过单因素分析法以MSN粒径作为指标进行了合成工艺的优化,确定了制备的最佳反应条件,即CTAB与TEOS摩尔比为1:5,搅拌速度为600 rpm,反应温度为80°C,反应时间为2 h以及滴加速度为1 m L/min。采用最佳反应条件合成的MSN平均粒径为116.47±0.91 nm,PDI为0.24±0.01。扫描电镜与透射电镜显示,单个MSN粒径为50 nm,形貌呈球形,分散性良好,介孔孔道有序。氮气吸附脱附实验结果提示,该MSN比表面积为745.799 m~2/g,孔容积为0.978cm~3/g,平均孔径为5.687 nm。在此基础上,采用两种薄膜水化法制备了共载hcGEM与Era的RGD修饰的p H敏selleck激酶抑制剂感脂质介孔二氧化硅(hcGEM/Era RGD-Lip-MSN),并通过改变MSN与脂质的投量比以及Era的投入量筛选出以hcGEM与Era最佳协同抑制摩尔比4:1载药的处方。在该处方下,hcGEM/Era RGD-Lip-MSN的平均粒径为140.57±2.93 nm,PDI为0.22±0.13,Zeta电位为-58.80±0.65 m V;hcGEM的包封率与载药量分别为37.45%与11.05%;Era的包封率与载药量分别为78.96%与4.89%,hcGEM与Era摩尔比为4.13:1。透射电镜显示,hcGEM/Era RGD-Lip-MSN的粒径在70 nm左右,表面覆有脂质膜。体外释放研究结果显示,hcGEM/Era RGD-Lip-MSN在中性释放条件下释放缓慢,在48 h时hcGEM与Era累计释放率分别为30.23%与44.71%;在酸性释放环境下释放初期表现出“突释”效应,在48 h时hcGEM与Era累计释放率分别为86.46%与79.24%,总体释放特性表现出p H响应释放特性,并基本按照hcGEM与Era摩尔比4:1释放。制备的hcGEM/Era RGD-Lip-MSN能包载最佳协同抑制摩尔比4:1的两种药物,体外释放特性满足预期要求,为后续的体内外实验研究奠定了基础。体外实验中,首先采用CCK8法进行了细胞毒性实验。结果显示,空白RGD-Lip-Galunisertib MWMSN对PANC-1细胞几乎无毒性;hcGEM/Era RGD-Lip-MSN处理组,hcGEM RGD-Lip-MSN处理组,hcGEM+Era处理组以及hcGEM处理组的IC_(50)分别为0.4302,1.635,0.3159以及1.327μmol/L。hcGEM/Era RGD-Lip-MSN处理组对PANC-1细胞的抑制效果显著强于hcGEM RGD-Lip-MSN处理组或hcGEM处理组(P<0.05),而与hcGEM+Era处理组相比,两者的细胞抑制率接近。细胞划痕实验结果表明,hcGEM/Era RGD-Lip-MSN处理组对PANC-1细胞的迁移抑制作用显著强于hcGEM处理组或Era处理组(P<0.01),但与hcGEM+Era处理组相比无显著差异(P>0.05)。采用试剂盒对不同药物处理组细胞内的ROS,MDA以及GSH含量进行了检测。结果显示,与hcGEM/Era Lip-MSN处理组相比,hcGEM/Era RGD-Lip-MSN可以显著提高胞内ROS与MDA含量,降低胞内GSH含量(P<0.05)。此外,与DMSO处理组相比,hcGEM能显著提高胞内ROS与MDA含量,降低胞内GSH含量(P<0.05)。Western blot结果显示,与hcGEM/Era Lip-MSN处理组相比,hcGEM/Era RGD-Lip-MSN处理组的胞内GPX4、xCT蛋白含量显著降低(P<0.05)。通过共聚焦显微镜检测了不同处理组细胞对荧光物质的摄取,发现共载水溶性荧光染料罗丹明B与脂溶性荧光染料香豆素6的RGD修饰的脂质介孔二氧化硅纳米粒(Rh B/C6 RGD-Lip-MSN)处理组细胞内的红色荧光强度最强,而绿色荧光强度与游离组相当,说明Rh B/C6 RGD-Lip-MSN可以有效将两种荧光物质靶向递送入PANC-1细胞内。最后,通过流式细胞术检测了不同药物处理组细胞存活情况。结果显示,hcGEM/Era RGD-Lip-MSN处理组的细胞存活率显著低于hcGEM/Era RGD-Lip-MSN+铁死亡抑制剂Ferrostatin-1(Fer-1)处理组(P<0.01),表明hcGEM/Era RGD-Lip-MSN对PANC-1细胞的增殖抑制作用部分来源于铁死亡,而这种效果可以被铁死亡抑制剂Fer-1抑制。hcGEM/Era RGD-Lip-MSN处理组的细胞存活率显著低于hcGEM/Era Lip-MSN处理组(P<0.05),说明hcGEM/Era RGD-Lip-MSN能更加有效地将hcGEM与Era递送入细胞来发挥更强的增殖抑制效果。体内药效学研究首先通过肿瘤组织块移植的方法建立了胰腺癌皮下移植瘤裸鼠模型,并通过分析裸鼠肿瘤体积大小,重量以及裸鼠体重变化等来评估不同药物制剂的体内抗肿瘤疗效与系统毒性。结果显示,hcGEM+Era给药组的肿瘤体积显著小于hcGEM给药组或Era给药组(P<0.05),说明hcGEM联合Era应用可以显著提高肿瘤抑制效果。hcGEM/Era RGD-Lip-MSN给药组的肿瘤体积显著小于hcGEM+Era给药组(P<0.05),并且hcGEM/Era RGD-Lip-MSN给药组的裸鼠体重逐渐增加而hcGEM+Era给药组的裸鼠体重下降明显(P<0.05),说明hcGEM/Era RGD-Lip-MSN共递送hcGEM与Era可以提高两药的肿瘤抑制效果,降低药物的毒副作用。hcGEM/Era RGD-Lip-MSN给药组的肿瘤体积始终略小于hcGEM/Era Lip-MSN给药组,说明hcGEM/Era RGD-Lip-MSN给药组的肿瘤抑制效果略优于hcGEM/Era Lip-MSN给药组。因此,hcGEM/Era RGD-Lip-MSN共递送hcGEM与Era可以在降低药物毒副作用的同时提高两药的肿瘤抑制效果。以上所有研究结果表明,本课题设计的hcGEM/Era RGD-Lip-MSN能同时包载递送铁死亡诱导剂Era与化疗药hcGEM,并通过联合不同的细胞死亡机制,RGD靶向递送以及p H敏感释放等设计在降低两药毒副作用的同时提高药物的肿瘤抑制效果,为基于铁死亡-化疗联合治疗策略的纳米递送系统研究提供数据参考。