背景肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)占原发性肝癌90%以上。由于HCC分子病理机制的复杂性和异质性,分子靶向治疗和免疫治疗仅对部分HCC患者有作用。因此,当前迫切需要进一步探讨HCC的生物学特性,进一步揭示HCC发病的分子机制,针对不同基因背景的HCC患者采取精准的个体化治疗将是进一步提高HCC预后的重要策略。mTOR(The mechanistic/mammBerzosertibalian target of rapamycin)通路调节细胞内多种代谢,参与调控恶性肿瘤的细胞增殖、存活和转移。mTOR分为mTORC1和mTORC2两种复合体。mTORC1主要参与代谢的调节,而mTORC2主要参与细胞骨架的调节。研究表明50%以上的HCC患者存在mTOR的异常过度活化。在调控mTOR的众多分子中,Tsc1/2的突变率最高。当Tsc1或Tsc2缺失或突变后,能影响Tsc复合体(tuberous sclerosis complex)的形成,从而导致mTOR的过度活化。p53在应对细胞内外各种应激中发挥重要作用,包括DNA损伤、癌基因激活、代谢失调、核糖体应激、端粒侵蚀、细胞衰老、诱导细胞死亡和细胞周期阻滞。正常情况下,体内外各种应激信号趋于稳定地激活p53,活化后的p53发挥关键的肿瘤抑制作用,从而避免了各种肿瘤的发生。p53的功能性缺失是多数肿瘤发生和增殖的先决条件,在我国的HCC中,p53突变率达58%。虽然Kras在HCC中的突变率仅为5%,但Ras/raf/Mek/Erk通路在HCC中的活化率却达50-100%。Kras基因编码一种小的与胞膜结合的GTPase,它的功能是参与受体酪氨酸激酶(Receptor Tyrosine Kinase,RTKs)的信号转导,以促进细胞增殖、细胞分化或细胞生存。Kras突变后会导致下游信号通路的持续活化,从而导致肿瘤的发生。虽然既往的研究已分别深入探讨了mTOR活化、p53突变和Kras突变促进HCC的作用及机制,但相互之间是否存在协同作用尚不明确。第一部分:p53突变伴mTOR过度活化促进肝细胞肝癌增殖和转移的机制研究目的1.明确p53突变与mTOR活化在促HCC增殖和转移过程中是否有协同作用。2.明确p53突变能否进一步活化mTOR,并明确其具体的分子机制。3.明确p53突变伴mTOR过度活化HCC潜在的治疗靶点。方法1.构建转基因小鼠:构建mTOR过度活化(Tsc1敲除)的转基因小鼠。由于p53完全敲除的小鼠无法存活,因此通过突变p53基因的单链来构建p53单倍体不足的转基因小鼠。再通过相互交配获取同时具备p53突变和Tsc1敲除的转基因小鼠。2.构建HCC模型:(1)自发成瘤模型:不作任何处理,持续观察转基因小鼠320天后再处死,统计转基因小鼠肝脏肿瘤的大小、数目、肝脏体重比及肺部转移灶的大小和数目。(2)诱导成瘤模型:在转基因小鼠15日时腹腔注射0.5mg/kg的二乙基亚硝胺(N-nitrosodiethylamine,DEN),并从小鼠21日起,连续17周,每周腹腔注射一次CCl4(0.5ml/kg),最后再观察4周。处死小鼠,统计肝脏肿瘤的大小、数目和肝脏体重比。3.利用苏木素-伊红染色、免疫组织化学染色、天狼猩红染色、Western blot、q PCR、原代细胞提取、药物抑制试验及CCK-8明确p53突变与mTOR过度活化在促进HCC增殖和转移过程中是否存在协同作用以及如何发挥协同作用。4.通过RNA-seq明确p53突变伴mTOR过度活化激活的下游底物。5.结合临床病例标本及公共数据库,分析上述底物与HCC的临床相关性。6.通过CCK-8和Transwell实验明确上述底物在HCC中的功能。7.通过转基因小鼠,明确mTOR是否作为p53突变伴mTOR过度活化HCC的治疗靶点。结果1.p53单倍体不足能进一步活化Tsc1缺失引起的mTOR活化,从而促进HCC的增殖和转移。2.p53单倍体不足主要通过Pten/PI3K/Akt通路进一步活化mTOR。同时使用PI3K和mTOR的抑制剂,能显著抑制p53突变伴Tsc1敲除转基因小鼠肝原代细胞mTOR通路的活性,及其增殖能力。3.p53单倍体不足协同Tsc1/mTOR活化下游分子ABCC4发挥促HCC增殖和转移的作用。4.ABCC4与p53突变HCC患者的预后显著相关,且ABCC4与HCC患者肿瘤的大小、分化、TNM分期和血管血栓形成密切相关。5.抑制ABCC4表达能显著抑制p53突变HCC细胞的增殖和转移。6.mTOR抑制剂能显著抑制p53突变伴Tsc1敲除转基因小鼠HCC的增殖。结论1.p53突变主要通过Pten/PI3K/Akt/mTOR轴与Tsc1/mTOR发挥协同作用,二者共同激活下游底物ABCC4,促进HCC的增殖和转移。2.mTOR可能是p53突变伴mTOR过度活化HCC临床有效的治疗靶点。第二部分:Kras突变伴mTOR过度活化促进肝细胞肝癌增殖和转移的机制研究目的1.明确Kras突变与mTOR活化在促HCC增殖和转移过程中是否有协同作用。2.明确Kras突变能否进一步活化mTOR及其具体的分子机制。3.明确Kras突变伴mTOR过度活化HCC潜在的治疗靶点。方法1.构建转基因小鼠:构建mTOR过度活化(Tsc1敲除)的BMS-354825转基因小鼠。由于Kras G12D突变的纯合子无法存活,因此只构建Kras G12D突变的杂合子转基因小鼠。通过相互交配获取同时具备Kras G12D突变和Tsc1敲除的转基因小鼠。2.构建HCC模型:不作任何处理,持续观察转基因小鼠280天,待小鼠肝脏自发成瘤后处死后,统计转基因小鼠肝脏肿瘤的大小、数目、肝脏体重比及肺部转移灶大小和数目。3.利用苏木素-伊红染色、免疫组织化学染色、天狼猩红染色、Western blot、q PCR、原代细胞提取技术、药物抑制试验、CCK-8及生物信息学分析明确Kras突变与mTOR过度活化在促进HCC增殖和转移过程中是否存在协同作用以及如何发挥协同作用。4.利用生物信息学分析、荧光显色、流式细胞学检测等实验明确在Tsc1完全缺失的情况下,Kras突变如何与mTOR发挥协同作用。5.通过RNA-seq明确Kras突变伴mTOR过度活化激活的下游底物分子。6.通过结合临床病例标本及公共数据库,分析上述底物与HCC的临床相关性。7.通过CCK-8和Transwellimmune cytokine profile实验明确上述底物在HCC中的功能。8.通过免疫共沉淀等实验明确与下游底物直接结合的其它蛋白,并探索分子机制。9.通过裸鼠皮下成瘤模型和尾静脉注射肺转移模型,明确上述底物在体内条件下对HCC增殖和转移的作用。10.通过原位种植瘤模型,明确mTOR是否能作为Kras突变伴mTOR过度活化HCC的治疗靶点。结果1.Kras突变能进一步活化Tsc1缺失引起的mTOR活化,从而促进HCC的增殖和转移。2.Kras突变主要通过Mek/Erk轴进一步活化mTOR。同时应用Mek和mTOR的抑制剂,能显著抑制Kras突变伴Tsc1敲除转基因小鼠肝原代细胞mTOR通路的活性,及其增殖能力。3.Kras突变会导致ROS的累积,高水平的ROS能介导Kras/Mek/Erk轴进一步活化Tsc1缺失引起的mTOR活化。4.Kras突变协同Tsc1/mTOR会活化下游分子PEG3。5.PEG3与Mek/Erk/mTOR轴活化的HCC患者的预后显著相关,且PEG3与HCC患者肿瘤的大小和UICC分期密切相关。6.在体内和体外抑制PEG3表达后都能显著抑制Kras突变伴Tsc1敲除HCC细胞的增殖和转移。7.PEG3与STAT3直接结合,促进p-STAT3Tyr705磷酸化激活,从而促进BEX2的表达增加,最终促使HCC的增殖和转移。8.mTOR抑制剂能显著抑制Kras突变伴Tsc1敲除HCC的增殖和转移。结论1.Kras突变通过Mek/Erk/ROS/mTOR轴与Tsc1/mTOR发挥协同作用,二者共同激活下游底物PEG3。PEG3与STAT3结合,促使p-STAT3Tyr705磷酸化激活,从而促进BEX2基因的表达,最终导致HCC的增殖和转移。2.mTOR可能是Kras突变伴mTOR过度活化HCC临床有效的治疗靶点。