研究背景类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis,RA)主要特征是关节滑膜的炎症和软骨、骨的进行性破坏。随着磁共振成像的使用,越来越多的研究发现RA骨髓水肿(Bone Marrow Edema,BME)是炎症反应的重要部位,故本研究以此为切入点,观察骨髓液对CD4+T淋巴细胞分化和破骨细胞(Osteoclasts,OC)分化及功能的影响。实验目的本研究从骨髓微环境/BME-CD4+T淋巴细胞-Th17/Treg对OC分化及功能的角度,探索益肾蠲痹丸(YSJB)改善RA骨破坏的作用机制及肾虚在RA发生发展中的作用。实验方法1.益肾蠲痹丸骨髓液的制备及检测选取8周龄雌性SD大鼠60只,按照随机数方法分为8组:空白对照组、假手术(Sham)组、Sham+胶原诱导性关节炎(CIA)组、Sham+CIA+益肾蠲痹丸(YSJB)组、卵巢摘除(OVX)组、OVX+CIA组、OVX+CIA+YSJB组、OVX+CIA+甲氨蝶呤(MTX)组。去势手术28d后开始免疫,初次免疫14d后开始灌胃给药。OVX+CIA+MTX组给予一次腹腔注射MTX,给药剂量为1.5 mg/kg 体重。Sham+CIA+YSJB 组、OVX+CIA+YSJB 组灌胃给予 YSJB,剂量为2.60 g/kg体重,每天2次,连续5 d。空白对照组、Sham组、OVX组、Sham+CIA组和OVX+CIA组灌服相同体积的纯净水。含药骨髓液的制备方法:取各组大鼠双侧股骨、胫骨,清洗干净后,用1 mL α-MEM培养基冲洗骨髓腔,收集冲洗液以330 g,5 min条件离心,取上清液,-80℃冻存备用。2.益肾蠲痹丸骨髓液对OC分化和功能的影响无菌条件下,取6周龄C57BL/6小鼠股骨、胫骨骨髓细胞,用α-MEM完全培养基培养24 h后,将未贴壁细胞用含25 ng/mL M-CSF的α-MEM完全培养基重悬后,接种于96孔培养板及预置有骨片的96孔培养板(4×104个/孔)、6孔培养板(8×105个/孔)中。72 h后弃上清,换成α-MEM分化培养基(含10%FBS+100 U/mL 青霉素+100μg/mL 链霉素+25 ng/mL M-CSF+50 ng/mL RANKL的α-MEM培养基)诱导,同时添加5%骨髓液,隔天换液。干预4 d后,采用TRAP染色方法观察OC分化情况;采用qPCR、Western-Blot方法检测 OC 中(NFATC-1、CTSK、MMP-9)mRNA 及 NFATC-1、CTSK、MMP-9 蛋白的表达水平;干预8 d后采用甲苯胺蓝染色法检测骨吸收功能。3.益肾蠲痹丸骨髓液对CD4+T淋巴细胞分化的影响无菌条件下,取SPF级6周龄C57BL/6小鼠脾脏,制备细胞悬液,采用磁珠的方法分选CD4+T淋巴细胞,将分选后的CD4+T淋巴细胞用含CD28抗体的α-MEM完全培养基重悬,接种于Anti-CD3包被的48孔板(1×106个/孔)孵育。2 h后加入5%各组骨髓液。干预2d后,收集各组细胞,采用qPCR检测CD4+T淋巴细胞中相关转录调控因子(RORγt、TNF-α、IL-17、Foxp3、TGF-β、IL-10)mRNA的表达水平,采用ELISA方法检测各组培养上清中TNF-α、IL-17A、TGF-β、IL-10蛋白的表达水平,观察CD4+T淋巴细胞向Th17细胞、Treg细胞分化的情况。4.益肾蠲痹丸骨髓液对CD4+T淋巴细胞-OC共培养体系的影响按前述方法分离骨髓来源OC,培养72 h后,换成α-MEM分化培养基,同时添加5%各组骨髓液和前述方法激活后的脾脏CD4+T淋巴细胞2×104个/孔,隔天换液。干预4 d后,进行TRAP染色观察及计数;采用免疫组化方法检测NFATC-1、CTSK、MMP-9蛋白表达水平;收集细胞培养上清液,检测其中TNF-α、IL-17A、TGF-β和IL-10等细胞因子的水平。干预8d后采用甲苯胺蓝染色法检测骨吸收陷窝面积。5.延胡索乙素(THP)对OC分化及功能的影响采用高效液相色谱和质谱的方法,对YJSB骨髓液中药物成分进行检测。结果在YSJB骨髓液中含有0.6ng/mLTHP。按前述方法分离培养骨髓来源的OC。在培养72 h后,加入不同浓度THP(终浓度为0.625、1.5625、3.125、6.25、12.5 μg/mL),并设不加THP的空白对照(Ctrl)组。每2d换液1次,干预4d后,进行TRAP染色观察OC分化情况并计数;采用qPCR、Western-Blot方法检测 OC 中(NFATC-1、CTSK、MMP-9)mRNA 及 NFATC-1、CTSK、MMP-9蛋白的表达水平;诱导8d后,采用甲苯胺蓝染色法检测骨吸收功能。研究结果1益肾蠲痹丸骨髓液对OC分化及功能的影响1.1益肾蠲痹丸骨髓液对OC分化及骨吸收功能的影响与Sham组相比,Sham+CIA组、OVX组、OVX+CIA组OC数量、骨吸收陷窝面积均明显增加(P<0.01)。OVX组与Sham+CIA组相比,无统计学差异。与OVX组和Sham+CIA组比较,OVX+CIA组OC数量、骨吸收陷窝面积明显增加(P<0.01)。Sham+CIA+YSJB组与Sham+CIA组相比,OC数量、骨吸收陷窝面积明显下降(P<0.01)。与OVX+CIA组相比,OVX+CIA+YSJB组、OVX+CIA+MTX组OC数量、骨吸收陷窝面积均明显下降(P<0.01)。1.2益肾蠲痹丸骨髓液对OC相关转录因子(NFATC-1、CTSK、MMP-9)mRNA表达的影响与Sham组相比,Sham+CIA组NFATC-1 mRNA表达有升高的趋势,但无统计学差异;Sham+CIA组CTSK、MMP-9 mRNA表达明显升高(P<0.01);OVX组、OVX+CIA 组NFATC-1、CTSK、MMP-9 mRNA 表达明显升高(P<0.05,P<0.01)。OVX组与Sham+CIA组相比,无统计学差异。与Sham+CIA组和OV X 组相比,OVX+CIA组NFAT-C-1、CTSK、mRNA 表达明显升高(P<0.01)。Sham+CIA+YSJB 组与 Sham+CIA 组相比,NFATC-1 mRNA 表达有下降的趋势,但无统计学差异;CTSK、MMP-9 mRNA表达明显下降(P<0.05,P<0.01)。与 OVX+CIA 组相比,OVX+CIA+YSJB 组和 OVX+CIA+MTX 组 NF ATC-1、CTSK mRNA表达明显下降(P<0.01)。1.3益肾蠲痹丸骨髓液对OC分化相关转录因子(NFATC-1、CTSK、MMP-9)蛋白表达的影响与Sham组相比,Sham+CIA组NFATC-1、MMP-9蛋白表达有升高的趋势,但无统计学差异;Sham+CIA组CTSK蛋白表达明显升高(P<0.05);OVX组MMP-9蛋白表达有升高的趋势,但无统计学差异;OVX组NFATC-1、CTSK蛋白表达明显升高(P<0.05,P<0.01);OVX+CIA组NFATC-1、CTSK、MMP-9蛋白表达明显升高(P<0.01)。OVX组与Sham+CIA组相比,无统计学差异。与 Sham+CIA 组、OVX 组相比,OVX+CIA 组 NFATC-1、CTSK、MMP-9蛋白表达明显升高(P<0.05,P<0.01)。Sham+CIA+YSJB组与Sham+CIA组相比,NFATC-1蛋白表达明显下降(P<0.05);CTSK、MMP-9蛋白表达有下降趋势,但无统计学差异。与OVX+CIA组相比,OVX+CIA+YSJB组和OVX+Cobimetinib molecular weightCIA+MTX 组 NFATC-1、CTSK、MMP-9 蛋白表达明显下降(P<0.05,P<0.01)。2益肾蠲痹丸骨髓液对CD4+T淋巴细胞分化的影响2.1益肾蠲痹丸骨髓液对CD4+T淋巴细胞调控因子(RORγt、TNF-α、IL-17、Foxp3、TGF-β、IL-10)mRNA 表达的影响与Sham组相比,Sham+CIA组RORγt、TNF-α、IL-17 mRNA表达有上升趋势,但无统计学差异;OVX组、OVX+CIA组RORγt、TNF-α、IL-17 mRNA表达均明显上升(P<0.05、P<0.01);Sham+CIA 组、OVX 组 Foxp3、TGF-β、IL-10 mRNA表达有下降的趋势,但无统计学差异;OVX+CIA组Foxp3 mRNA表达明显下降(P<0.01);OVX+CIA组TGF-β、IL-10 mRNA表达有下降趋势,但无统计学差异。与Sham+CIA组相比,OVX+CIA组RORγt、TNF-α、IL-17mRNA表达明显上升(P<0.05,P<0.01);OVX+CIA 组Foxp3 mRNA 表达明显下降(P<0.01);OVX+CIA组TGF-β、IL-10mRNA有下降趋势,但无统计学差异。与OVX组相比,OVX+CIA组RORγt mRNA表达明显上升(P<0.01);OVX+CIA组TNF-α、IL-17 mRNA表达有上升趋势,但无统计学差异;OVX+CIA组Foxp3、TGF-β、IL-10mRNA有下降趋势,无统计学差异。Sham+CIA+YSJB 组与 Sham+CIA 组相比,RORγt、TNF-α、IL-17 mRNA 表达有下降趋势,但无统计学差异;Foxp3、TGF-biocultural diversityβ、IL-10 mRNA有上升趋势,无统计学差异。与 OVX+CIA 组相比,OVX+CIA+YSJB 组和 OVX+CIA+MTX组RORγt、TNF-α、IL-17 mRNA 表达均明显下降(P<0.01);OVX+CIA+YSJB 组 Foxp3有升高趋势,无统计学差异;OVX+CIA+YSJB组TGF-β、IL-10 mRNA表达明显上升(P<0.05、P<0.01);OVX+CIA+MTX 组 Foxp3、TGF-β、IL-10 mRNA表达明显上升(P<0.01)。2.2益肾蠲痹丸骨髓液对CD4+T淋巴细胞分泌的细胞因子(TNF-α、IL-17、TGF-β、IL-10)蛋白含量的影响与Sham组相比,Sham+CIA组、OVX组、OVX+CIA组细胞培养上清中TNF-α、IL-17A 蛋白含量均明显上升(P<0.05,P<0.01),Sham+CIA 组、OVX组、OVX+CIA组细胞培养上清中TGF-β、IL-10蛋白含量明显下降(P<0.01)。与Sham+CIA组相比,OVX+CIA组细胞培养上清中TNF-α、IL-17A蛋白含量有上升趋势,但无统计学差异;OVX+CIA组细胞培养上清中TGF-β、IL-10蛋白含量明显下降(P<0.05,P<0.01)。与OVX组相比,OVX+CIA组细胞培养上清中TNF-α、IL-17A蛋白含量有上升趋势,但无统计学差异;OVX+CIA组细胞培养上清中TGF-β蛋白含量明显下降(P<0.01),OVX+CIA组细胞培养上清中IL-10蛋白含量有下降趋势,但无统计学差异。Sham+CIA+YSJB组与Sham+CIA组相比,细胞培养上清中TNF-α、IL-17A蛋白含量明显下降(P<0.05,P<0.01);细胞培养上清中TGF-β蛋白含量明显上升(P<0.05);细胞培养上清中IL-10蛋白含量有上升趋势,但无统计学差异。与OVX+CIA组相比,OVX+CIA+YSJB组和OVX+CIA+MTX组细胞培养上清中 TNF-α、IL-17A 蛋白含量均明显下降(P<0.05,P<0.01);OVX+CIA+YSJB组和OVX+CIA+MTX组细胞培养上清中TGF-β蛋白含量均明显上升(P<0.01);OVX+CIA+YSJB组细胞培养上清中IL-10蛋白含量有上升趋势,但无统计学差异;OVX+CIA+MTX组细胞培养上清中IL-10蛋白含量明显上升(P<0.01)。3益肾蠲痹丸骨髓液对CD4+T-OC共培养体系的影响3.1益肾蠲痹丸骨髓液对CD4+T-OC共培养体系中OC分化、骨吸收功能的影响与Sham组相比,Sham+CIA组、OVX组、OVX+CIA组OC数量、骨吸收陷窝面积均明显增加(P<0.01);OVX组与Sham+CIA组相比,OC数量明显上升(P<0.01),骨吸收陷窝无明显差异。与Sham+CIA组相比,OVX+CIA组OC数量、骨吸收陷窝面积明显增加(P<0.01)。与OVX组相比,OVX+CIA组OC数量、骨吸收陷窝面积明显增加(P<0.01);Sham+CIA+YSJB组与Sham+CIA组相比,OC数量、骨吸收陷窝面积明显下降(P<0.01);与OVX+CIA组相比,OVX+CIA+YSJB组、OVX+CIA+MTX组OC数量、骨吸收陷窝面积均明显下降(P<0.01)。3.2益肾蠲痹丸骨髓液对CD4+T-OC共培养体系中OC分化相关蛋白表达的影响与 Sham 组相比,Sham+CIA 组、OVX 组 NFATC-1、CTSK、MMP-9 蛋白表达有上升趋势,但无统计学差异;OVX+CIA组NFATC-1、CTSK蛋白表达明显上升(P<0.05,P<0.01);OVX+CIA组MMP-9蛋白表达有上升趋势,但无统计学差异。与Sham+CIA组比较,OVX+CIA组NFATC-1、MMP-9蛋白表达有上升趋势,但无统计学差异;OVX+CIA组CTSK蛋白表达明显升高(P<0.01)。与OVX组比较,OVX+CIA组NFATC-1、MMP-9蛋白表达有上升趋势,但无统计学差异;OVX+CIA组CTSK蛋白表达明显增多(P<0.01)。Sham+CIA+YSJB组与Sham+CIA组相比,NFATC-1蛋白表达明显下降(P<0.01);CTSK、MMP-9蛋白表达有下降趋势,但无统计学差异。与OVX+CIA组相比,OVX+CIA+YSJB组MMP-9蛋白表达有下降趋势,但无统计学差异;OVX+CIA+YSJB组NFATC-1、CTSK蛋白表达均明显下降(P<0.01)OVX+CIA+MTX 组 NFATC-1、CTSK、MMP-9 蛋白表达均明显下降(P<0.05,P<0.01)。3.3益肾蠲痹丸骨髓液对共培养体系中CD4+T淋巴细胞分泌(TNF-α、IL-17、TGF-β和IL-10)蛋白含量的影响与Sham组相比,Sham+CIA组、OVX组、OVX+CIA组细胞培养上清中TNF-α、IL-17A蛋白含量均明显上升(P<0.05,P<0.01)。Sham+CIA组、OVX组、OVX+CIA组细胞培养上清中TGF-β蛋白含量有下降趋势,但无统计学差异;Sham+CIA组、OVX组、OVX+CIA组细胞培养上清中IL-10蛋白含量均下降(P<0.01)。与Sham+CIA组相比,OVX+CIA组细胞培养上清中TNF-α蛋白含量有上升趋势,但无统计学差异;OVX+CIA组细胞培养上清中IL-17A蛋白含量明显上升(P<0.05);OVX+CIA组细胞培养上清中TGF-β、IL-10蛋白含量有下降趋势,但无统计学差异。与OVX组相比,OVX+CIA组细胞培养上清中TNF-α蛋白含量有上升趋势,但无统计学差异;OVX+CIA组细胞培养上清中IL-17A蛋白含量明显上升(P<0.05);OVX+CIA组细胞培养上清中TGF-β、IL-10蛋白含量有下降趋势,但无统计学差异。Sham+CIA+YSJB组与Sham+CIA组相比,细胞培养上清中TNF-α蛋白含量有下降趋势,但无统计学差异;细胞培养上清中IL-17A蛋白含量明显下降(P<0.01);细胞培养上清中TGF-β、IL-10蛋白含量有上升趋势,但无统计学差异。与OVX+CIA组相比,OVX+CIA+YSJB组和OVX+CIA+MTX组细胞培养上清中TNF-α、IL-17A蛋白含量均明显下降(P<0.01);OVX+CIA+YSJB组细胞培养上清中TGF-β蛋白含量有上升趋势,但无统计学差异;OVX+CIA+YSJB组细胞培养上清中IL-10蛋白含量明显上升(P<0.01);OVX+CIA+MTX组细胞培养上清中TGF-β、IL-10蛋白含量明显上升(P<0.01)。4延胡索乙素(THP)对OC分化及功能的影响4.1益肾蠲痹丸骨髓液成分检测益肾蠲痹丸骨髓液中检测到THP、马兜铃酸,其中THP含量为0.6ng/mL,马兜铃酸存在基质干扰。因此本实验开展了 THP对OC分化及功RAD001能影响的探索。4.2THP对OC分化、骨吸收功能的影响随着THP浓度的增加,OC数量、骨吸收陷窝面积逐渐减少,并具有剂量依赖性。同空白对照组(Ctrl组)相比,0.625、1.5625、3.125、6.25、12.5μg/mLTHP均能明显抑制OC的分化、吸收功能(P<0.01)。4.3 THP 对 OC 相关转录因子(NFATC-1、CTSK、MMP-9)mRNA 及(NFATC-1、CTSK、MMP-9)蛋白表达的影响与 Ctrl组相比,除 THP 0.625 μg/mL组 CTSK mRNA表达无统计学差异,其余各组NFATC-1、CTSK、MMP-9 mRNA 及 NFATC-1、CTSK、MMP-9蛋白表达均显著降低(P<0.01),且呈剂量依赖性。结论CIA、肾虚和肾虚CIA大鼠骨髓液既可以直接促进OC分化及吸收功能;又可以促进CD4+T淋巴细胞向Th17分化发生偏移,间接促进OC的分化及吸收功能,且肾虚CIA大鼠骨髓液对OC分化及吸收功能的促进作用更明显。YSJB干预的CIA大鼠骨髓液和肾虚CIA大鼠骨髓液,均能抑制单独培养和共培养体系中OC的分化及吸收功能,并且YSJB干预的肾虚CIA大鼠骨髓液作用更明显。THP可能是YSJB的主要活性物质之一。其作用机制是YSJB大鼠骨髓液通过下调CD4+T淋巴细胞TNF-α、IL-17的表达,促进TGF-β、IL-10的分泌,恢复Th17/Treg平衡,进而抑制OC的分化和功能。本研究为“从肾论治”RA提供了实验依据,也为“肾主水、主骨生髓理论”提供了进一步的依据。