目的:应激是指机体在受到各种应激源的刺激之后,通过内分泌系统、神经系统以及其他各个系统的共同参与以及共同调节,为了应对危险从而做出的全身性的综合反应。适当的应激反应可促使机体调节各个系统的代谢水平,増加各系统的内稳态能力,进而减少危险因素对机体造成的伤害,但是过度的应激反应可能会造成机体的损伤,从而影响机体正常的心理状态或生理功能。铁死亡是近年来国内外的研究热点之一,我团队前期研究表明束缚应激可导致多脑区的病理性损伤,但铁死亡在应激性脑损伤中是否发挥作用尚属未知。迄今为止的研究提示,应激可能会引起脑内铁稳态失去平衡。铁离子是生物体所必需的一种微量元素,它参与机体内多种生物过程。2012年,布伦特·斯托克韦尔博士的实验室正式定义了铁死亡,是由铁依赖性的氧化损伤所引起的,区别于细胞凋亡、细胞自噬的新型细胞程序性死亡。铁死亡具有线粒体膜面积减少且嵴减少、细胞内铁含量增加、细胞内脂质ROS积累等特点。而线粒体的改变与胞内脂质ROS累积同样在应激性脑损伤中可以观察到,因而我们推测应激性脑损伤的发生过程中有铁死亡的参与,因此,本实验对铁死亡相关蛋白表达变化进行了系统观察研究,旨在探究应激状态下,铁死亡相关蛋白的表达的动态变化及作用机制,为应激性脑损伤机制研究提供科学学依据。方法:将30只C57BL/6小鼠按随机数字表法分为急性组、慢性组、对照组,每组10只。急性组小鼠每日束缚16 h,共3天;慢性组每日束缚6-8 h,共3周;对照组不做任何处理。通过观察应激结束后小鼠旷场行为学改变、糖皮质激素受体(Glucocorticoid Receptor,GR)在海马、下丘脑、皮层三个脑区的表达以及应激前后小鼠体重变化三个指标来评价应激模型是否成功建立;生化检测小鼠血清中谷胱甘肽(Glutathione,GSH)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)以及铁离子的含量;HE染色观察小鼠大脑海马、皮层、下丘脑三个脑区的常规病理学改变;甲苯胺蓝染色观察小鼠大脑海马、皮层、下丘脑三个脑区神经细胞尼氏体形态改变;透射电镜观察小鼠大脑海马脑区的超微结构改变;IHC染色观察小鼠大脑海马、皮层、下丘脑三个脑区铁死亡相关蛋白:转铁蛋白(Transferrin,TF)、转铁蛋白受体(Transferrin receptor,TFR)、二价金属离子转运体(Divalentmetal-iontransporter-1,DMT1)、溶质载体家族7成员11(Solute Carrier Family7 Member 11,SLC7A11)、谷胱甘肽过氧化物酶4(Glutathione peroxidase 4,GPX4)的表达变化以及采用Aperio.Scan Scope.CS2全景扫描仪进行蛋白表达的半定量分析;Western-blot方法检测小鼠大脑海马、下丘脑三个脑区铁死亡相关蛋白TF、TFR、DMT1、SLC7A11、GPX4的表达;RT-qPCR检测小鼠海马组织中TF、DMT1、GPX4三个指标mRNA的表达变化。结果处理及统计学分析:本实验中数据整理采用Excel 2016完成,用SPSS 23.0统计软件进行统计学分析。符合正态性检验和方差齐性检验的生化检测血液中的谷胱甘肽、丙二醛、铁离子含量数据均用均值±标准误(mean±SEM)表示,各组均数的比较行单因素方差分析(One-way ANOVA),用最小显著差法(least significant difference,LSD)作两两比较;对海马、下丘脑、皮层三个脑区中实验组与对照组之间免疫组化染色阳性强度值采用两独立样本t检验进行比较。以上统计结果均以P<0.05为有显著统计学差异。结果:1.体重变化与行为学实验结果:体重统计结果显示,急、慢性束缚组小鼠的最终体重低于初始体重,对照组小鼠最终体重高于初始体重。急、慢性束缚组小鼠体重下降幅度均显著大于对照组。旷场实验结果显示急、慢性束缚组小鼠的总移动距离与中央区移动距离较对照组小鼠显著降低。急性组的中心区累计持续时间与对照组相比明显减少,慢性组与对照组之间无明显差异。2.生化检测结果:实验组小鼠海马与下丘脑中GSH的含量与对照组相比明显降低,而MDA的含量则呈升高趋势。急、慢性束缚组小鼠血清中铁离子含量显著低于对照组。3.HE染色结果:急性组小鼠海马部位的神经细胞明显水肿,齿状回与周围组织间隙增大,细胞轮廓不清晰,部分细胞固缩浓染,少量细胞内染色质缺失,染色变浅;皮层部分神经细胞水肿,胞浆红染的红色神经元数目较多,清晰的细胞核结构消失;下丘脑部分神经细胞轻度水肿、固缩。慢性组小鼠三个脑区均出现神经细胞轻度水肿,皮层出现少量红色神经元;对照组小鼠未见明显病理改变。4.甲苯胺蓝染色结果:甲苯胺蓝染色结果显示实验组三个脑区的神经细胞均有不同程度的水肿,部分尼氏体结构消失,部分细胞出现固缩浓染的病理性改变。5.透射电镜结果:超微结构显示,三天组与三周组小鼠海马组织与对照组相比出现细胞内线粒体肿胀,同时伴有线粒体脊减少甚至消失、线粒体膜密度增加,部分线粒体外膜破裂或出现线粒体肿胀的病理改变。6.免疫组织化学染色结果:6.1.海Roxadustat作用马、下丘脑、皮层三个脑区应激指标的免疫组化结果:急、慢性束缚组小鼠在包含海马、下丘脑、皮层三个脑区的切片中的阳性表达整体相较对照组明显升高。6.2.海马、下丘脑、皮层三个脑区铁死亡相关蛋白指标的免疫组化结果:6.2.1.TF在海马、下丘脑、皮层的表达情况:TF在小鼠大脑海马部位的免疫组化结果显示,与对照组相比,急、慢性束缚组的表达水平均显著升高;下丘脑的结果显示,与对照组相比,急、慢性束缚组的表达水平均明显升高;大脑皮层的结果显示,与对照组相比,急性束缚组的表达水平明显升高,慢性束缚组的表达水平未见明显差异。6.2.2.TFR在海马、下丘脑、皮层的表达情况:TFR在小鼠大脑海马与皮层两个脑区的免疫组化结果显示,与对照组相比,急、慢性束缚组的表达水平均显著升高;下丘脑的免疫组化结果显示,与对照组相比,急性束缚组的表达水平明显升高,慢性束缚组的表达水平未见明显差异。6.2.3.DMT1在海马、下丘脑、皮层的表达情况:DMT1在小鼠大脑海马、皮层、下丘脑三个脑区的免疫组化结果显示,与对照组相比,急、慢性束缚组的表达水平均显著升高。6.2.4 SLC7A11在海马、下丘脑、皮层的表达情况persistent infection:SLC7A11在小鼠大脑海马部位的免疫组化结果显示,与对照组相比,急、慢性束缚组的表达水平未见明显差异;大脑皮层与下丘脑部位的结果显示,与对照组相比,急、慢性束缚组的表达水平显著降低。6.2https://www.selleck.cn/products/valemetostat-ds-3201.html.5 GPX4在海马、下丘脑、皮层的表达情况:GPX4在小鼠大脑海马部位的免疫组化结果均显示,与对照组相比,急、慢性束缚组的表达水平未见明显差异;大脑皮层与下丘脑部位的结果显示,与对照组相比,急、慢性束缚组的表达水平均可见显著下降。7.Western-Blot结果:7.1.TF在海马、下丘脑的表达情况:TF在小鼠大脑海马部位的WB结果显示,与对照组相比,急、慢性束缚组的表达水平均显著升高;下丘脑部位的WB显示,慢性组的表达水平高于对照组,急性组与对照组的没有明显差异。7.2.TFR在海马、下丘脑的表达情况:TFR在小鼠大脑海马与下丘脑两个脑区的WB结果均显示,与对照组相比,慢性组的表达水平显著升高;急性组的表达水平未见明显差异。7.3.DMT1在海马、下丘脑的表达情况:DMT1在小鼠大脑海马WB结果显示,慢性组的表达水平高于对照组,急性组与对照组的没有明显差异;下丘脑的WB结果显示,与对照组相比,急、慢性束缚组的表达水平均显著升高。7.4.SLC7A11在海马、下丘脑的表达情况:SLC7A11在小鼠大脑海马部位的WB结果显示,与对照组相比,急、慢性束缚组的表达水平均明显低于对照组;下丘脑部位的结果显示,慢性组的表达水平显著低于对照组,急性组与对照组无明显差异。7.5.GPX4在海马、下丘脑的表达情况:GPX4在小鼠大脑海马部位的WB结果均显示,与对照组相比,急、慢性束缚组的表达水平均显著下降;下丘脑的结果显示,与对照组相比,慢性组的表达水平低于对照组,急性组与对照组无显著差异。8.RT-qPCR结果:TF mRNA的表达在实验组与对照组之间没有差异。三天组DMT1的mRNA表达增加,三周组与对照组没有差异。GPX4 mRNA三天组与三周组均低于对照组,有统计学差异。结论:本实验在成功建立C57BL/6小鼠束缚应激模型的基础上,分别探讨了海马、皮层、下丘脑的病理学改变及引发病理学改变的分子机制,得出以下结论:1.束缚应激小鼠体重减轻,行为学活动减弱,海马、下丘脑、皮层中糖皮质激素受体含量增高,提示应激模型建立成功。2.束缚应激组小鼠海马、下丘脑、皮层的HE染色、甲苯胺蓝染色、透射电镜结果显示,神经细胞病理性改变明显,表明应激可致神经细胞病理性损伤。3.束缚应激可致与铁死亡密切相关的氧化反应TF、TFR、DMT的mRNA与蛋白表达增高及抗氧化反应GPX4与SLC7A11的表达降低,提示铁死亡参与了应激诱导的神经细胞损伤。