肝细胞癌(Hepatocellular carcinoMDV3100核磁ma,HCC)是全球第四大癌症死亡原因。目前,手术切除、化疗栓塞和全身治疗是干预HCC最常见的方法,但其具有较大的毒副作用与耐药性。近年来steamed wheat bun研究发现,HCC中肿瘤细胞与周围免疫细胞之间的串扰是支持肿瘤发生和免疫逃避的重要机制。在HCC复杂的生态系统中,肿瘤相关巨噬细胞(Tumor-associated macrophage,TAM)是肿瘤浸润的主要免疫细胞。TAM具有可塑性,可根据不同微环境响应改变其表型,抑制或加速肿瘤生长、转移与代谢重编程等。因此,靶向TAM似乎是调控HCC微环境的一种重要的干预策略。紫锥菊(Echinacea purpurea(L.)Moench,Ep)原产于北美洲,是欧美使用最广泛的膳食补充剂之一,具有安全性高、价格低和生物活性广等的优点。紫锥菊是国际公认的“免疫调节剂”,可增强巨噬细胞与淋巴细胞等的功能,发挥抗炎、抗肿瘤和肝脏保护等作用。临床研究显示,紫锥菊是干预肝癌及其他癌症病人化疗中最常见的辅助性治疗植物之一。而国内外相关学者在紫锥菊干预肝癌方面的基础研究较薄弱,还未能阐明紫锥菊对HCC微环境的影响与作用机理等。因此,本文提出以下科学问题:(1)国内引种紫锥菊是否对HCC具有干预活性?(2)其干预效果是直接作用于肿瘤细胞?还是通过间接作用于免疫细胞提高免疫功能?(3)干预机制是什么?(4)有效成分有哪些?基于以上科学问题,开展如下研究:(1)紫锥菊及其活性成分研究:利用NMR代谢组学方法考察不同产地紫锥菊地上部分与根的代谢物水平;并通过体外实验考察其免疫活性差异;采用相关分析研究影响紫锥菊代谢物与活性的环境因素。通过偏最小二乘回归分析初探紫锥菊免疫活性成分。结果表明土壤p H和年降水量分别是影响紫锥菊代谢物含量及巨噬细胞免疫活性的主要因素,且山东与湖南紫锥菊地上部分代谢物含量丰富、免疫活性较强,可作为紫锥菊优势产地。氨基酸与酚酸类化合物是紫锥菊发挥免疫调节作用的活性成分群。(2)紫锥菊干预肝癌免疫微环境作用研究:建立Hepa1-6细胞诱导的小鼠HCC模型,探究紫锥菊对HCC的干预效果;通过体外实验,考察紫锥菊对肝癌细胞的直接作用;建立肝癌细胞与巨噬细胞共培养模型,评价紫锥菊对HCC微环境的干预作用。体内实验结果表明,紫锥菊改善HCC小鼠肿瘤的生长、迁移与上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal selleck抑制剂transition,EMT),抑制炎症因子IL-6与IL-10分泌,降低巨噬细胞M2表型比例。体外实验结果表明,紫锥菊可直接抑制肝癌细胞的活力、迁移、侵袭与EMT。共培养实验结果表明,Hepa1-6细胞促进巨噬细胞M2极化与IL-6及IL-10分泌,巨噬细胞介导也加速了Hepa1-6细胞增殖、迁移、侵袭与EMT。紫锥菊干预抑制巨噬细胞向M2极化,降低IL-6分泌,增强对肝癌细胞生长的干预效果,提示紫锥菊可干预巨噬细胞极化与炎症因子表达调控HCC免疫微环境。(3)紫锥菊干预肝癌免疫微环境作用机制研究:利用网络药理学、代谢组学及实验验证的方法,阐明紫锥菊干预HCC免疫微环境的机制。网络药理学结果表明IL-6/STAT3及PI3K/AKT通路是紫锥菊调控巨噬细胞干预HCC微环境的潜在机制。代谢组学结果表明紫锥菊可显著干预HCC小鼠14个血清与11个尿液代谢物,苯丙氨酸代谢是紫锥菊干预HCC代谢重编程的关键途径。紫锥菊明显下调肿瘤组织中IL-6/STAT3通过关键蛋白IL-6、p-JAK1、p-STAT3及STAT3表达,减少PI3K/AKT信号中p-PI3K与p-AKT含量,降低苯丙氨酸代谢关键蛋白PAH水平。体外实验中加入IL-6,模拟共培养条件下巨噬细胞分泌,结果表明紫锥菊可阻断IL-6诱导的STAT3激活,抑制PI3K与AKT蛋白磷酸化,调控肝癌细胞苯丙氨酸代谢,发挥其免疫调控作用。(4)紫锥菊干预肝癌免疫微环境的活性成分研究:利用体外共培养实验,对网络药理学预测的12种潜在活性成分进行筛选,结果表明菊苣酸、绿原酸、酒石酸、2-苯基乙基-吡喃葡萄糖苷及异甘草素是有效成分。分子对接与验证实验结果表明,菊苣酸与HCC免疫微环境相关靶点均具有良好的结合活性,是干预肝癌最主要的有效成分;绿原酸通过靶向IL-6/STAT3信号调控肝癌免疫微环境;酒石酸通过调节苯丙氨酸代谢与IL-6/STAT3通路干预肝癌细胞的增殖与凋亡;2-苯基乙基-吡喃葡萄糖苷通过靶向IL-6/STAT3与PI3K/AKT通路干预肝癌迁移;异甘草素通过调节苯丙氨酸代谢干预HCC代谢重编程。(5)紫锥菊复合制剂的开发及应用:利用体外细胞实验获得紫锥菊复合制剂最佳配比。通过小鼠HCC模型探究紫锥菊复合制剂、紫锥菊及紫锥菊复合制剂与阳性药联用对HCC免疫微环境的干预作用。结果表明紫锥菊复合制剂可显著降低5-FU造成的肝脏毒性,提高对HCC生长、迁移、EMT的抑制作用,促进巨噬细胞向M1型转变,促进TNF-α释放,降低IL-6分泌,调节IL-6/STAT3与PI3K/AKT通路关键蛋白表达,且其干预HCC效果优于单一紫锥菊。网络药理学分析表明紫锥菊复合制剂干预HCC效果较优的原因与多成分的协同作用有关。紫锥菊及紫锥菊复合制剂与阳性药联用可发挥增效解毒作用,表明与紫锥菊或紫锥菊复合制剂联用是提高肝癌临床干预效果的有效策略。综合以上,紫锥菊对HCC细胞和动物模型均显示出良好的干预效果,其作用与紫锥菊重塑HCC微环境中巨噬细胞表型、调控炎症因子释放,干预苯丙氨酸代谢有关,IL-6/STAT3与PI3K/AKT信号是其潜在的作用机制。菊苣酸、绿原酸、酒石酸、2-苯基乙基-吡喃葡萄糖苷及异甘草素是免疫微环境中发挥抗HCC的有效成分。因此,紫锥菊及活性成分是提高免疫功能、预防与治疗HCC的潜在物质,紫锥菊复合制剂及与化药联用的研究为我国的特医食品的开发奠定一定的实验基础。