背景:帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是最常见的神经退行性疾病之一,主要病理特征为黑质致密部多巴胺能(dopamine,DA)神经元选择性、进行性丢失,神经元内路易小体(lewy body,LB)形成和胶质细胞增生。神经毒素1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP)诱导的小鼠损伤模型是最常用的PD动物模型之一,但现有研究对MPTP诱导的PD小鼠模型是否表现出显著的运动及情绪相关的非运动障碍仍存有争议。部分PD患者在运动症状出现之前常伴有焦虑症状,严重影响患者的生活质量。但现有治疗手段对情绪症状无明显疗效,PD伴焦虑的发生机制和涉及的神经环路尚不清楚。腹侧被盖区(ventral tegmental area,VTA)是中脑皮层边缘回路的中心,通过与多个脑区形成功能连接,将外界的刺激信息和反馈输出行为联系起来,参与焦虑情绪的表达及调节。鉴于此,本研究拟应用MPTP构建亚急性PD小鼠模型,观察分析不同剂量处理下小鼠纹状体和腹侧中脑区域多巴胺神经元损伤程度、小鼠行为表型的变化情况。同时结合化学遗传的技术,观察VTA神经元激活后对小鼠焦虑行为的影响。目的:通过在体实验D-Lin-MC3-DMA试剂,观察MPTP的诱导的亚急性损伤小鼠行为表型及纹状体和腹侧中脑区域多巴胺神经元损伤程度;明确在MPTP诱导的亚急性PD小鼠模型的基础上,扰乱残余VTA区域神经元的平衡,是否会诱导小鼠出现焦虑表型,由此建立一个稳定的伴有焦虑状态的PD前驱期小鼠模型,明确PD前驱期伴焦虑状态下VTA区域的神经元是否参与焦虑状态的神经环路。方法:2月龄SPF级C57BL/6J小鼠,体重20-25 g,采用腹腔注射MPTP制备亚急性PD模型,利用脑立体定位技术在VTA部位注射AAV-9-hSyn-HA-hM3DqIRES-mCitrine病毒载体。运用小动物全自动智能分析笼、旷场、转棒、步态、高架十字迷宫、悬尾及Zn biofortification强迫游泳等行为学实验检测小鼠的运动及焦虑抑郁相关的情绪障碍;Western blot检测纹状体及腹侧中脑多巴胺转运体(dopamine transporter,DAT)、突触核蛋白(alpha-synulein,α-Syn)、酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)、凋亡坏死标志物混合系列蛋白激酶样结构域(mixed Lineage Kinase Domain-Like,MLKL)和NOD样受体蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3,NLRP3)炎症小体蛋白表达情况;免疫荧光检测纹状体及腹侧中脑的DA神经元、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)及钙离子结合受体分子-1(ionized calcium binding adapter molecule 1,Iba1)阳性细胞的表达及分布情况;运用化学遗传技术选择性激活VTA区域神经元后,进行旷场、悬尾及高架十字迷宫实验检测小鼠的运动及焦虑抑郁相关的情绪障碍;免疫荧光检测VTA中HA标签与DA神经元、谷氨酸能(glutamate,Glu)神经元及γ氨基丁酸(γ-aminobutyrate,GABA)神经元共表达情况;免疫荧光检测VTA、伏隔核(nucleus accumbens,NAc)、腹侧海马体(ventral hippocampus,vHPC)、基底外侧杏仁核(basolateral amygdala,BLA)及内侧前额叶皮层(medial prefrontal cortex,mPFC)各脑区c-fos阳性细胞的表达分布情况。结果:研究一MPTP诱导的帕金森病模型小鼠行为表型的初步研究:1.MPTP(160 mg/kg)诱导的亚急性损伤小鼠不表现出显著的运动障碍,仅表现轻微步态异常;2.MPTP(160 mg/kg)PD模型小鼠诱导黑质和纹状体损伤并表现显著的神经炎症反应;3.MPTP(160 mg/kg)诱导的亚急性损伤小鼠腹侧中脑和纹状体区域星形胶质细胞增生明显,小胶质细胞激活;4.MPTP(240 mg/kg)诱导的亚急性损伤小鼠不表现出显著的运动障碍,表现步态异常;5.MPTP(240 mg/kg)诱导的亚急性损伤小鼠不表现出显著的焦虑抑郁障碍;6.MPTP(240 mg/kg)PD模型小鼠显著诱导黑质和纹状体损伤;7.MPTP(240 mg/kg)诱导的亚急性损伤小鼠VTA区域神经元发生激活;研究二基于化学遗传技术探索VTA神经元对小鼠焦虑行为的调节作用:1.化学遗传激活雌性和雄性小鼠的VTA区域神经元显著增强小鼠在应激环境中的固有防御反应;2.化学遗传激活雌性和雄性小鼠的VTA区域神经元诱导小鼠出现焦虑样表型;3.化学遗传激活VTA区域神经元参与调节小鼠焦虑样表型;4.VTA-NAc DA神经元可能参与小鼠的焦虑样表型;5.VTA-vHPCselleckchem DA神经元可能参与小鼠的焦虑样表型;6.VTA-BLA DA神经元可能参与小鼠的焦虑样表型;7.VTA-mPFC神经环路可能参与小鼠的焦虑样表型。结论:研究一MPTP诱导的帕金森病模型小鼠行为表型的初步研究1.MPTP诱导的亚急性PD小鼠对应于临床上PD患者的前驱期状态——小鼠腹侧中脑内DA神经元大量丢失,星形胶质细胞弥漫增生,但并不表现出显著的运动障碍和情绪障碍。研究二基于化学遗传技术探索VTA神经元对小鼠焦虑行为的调节作用1.激活VTA神经元,尤其是DA神经元,能够诱导小鼠出现焦虑样行为;MPTP诱导的亚急性损伤小鼠,由于VTA DA神经元的部分丢失,其焦虑表型有所缓解;2.VTA、NAc、vHPC、BLA以及mPFC各神经元共同构成焦虑相关细胞集群参与小鼠焦虑样行为的调节。