L-精氨酸及其代谢产物NO、多胺、鸟氨酸、脯氨酸等在调节机体代谢、促进激素分泌、改善免疫功能、预防心血管疾病和内皮细胞功能紊乱、维持骨骼肌和大脑功能、修复损伤组织等多个方面发挥重要功能。由于其巨大的医药、食品价值,如何大规模生产L-精氨酸引起了国内外研究者广泛的关注。目前L-精氨酸的生产方式主要是微生物发酵法,该方法的关键在于选育一株产量高,稳定遗传的工程菌株。钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)是我国科研工作者从土壤中分离得到的,由于其不含内毒素、遗传背景清晰和培养成本低等特性,常作为底盘微生物用于构建精氨酸高产菌株。因此,本研究以C.crenatum为宿主菌株进行遗传改造,通过优化磷酸戊糖途径、TCA循环途径和NAD激酶基因的表达,以增强辅因子NADPH的供应,解除碳氮全局转录因子对碳氮源吸收途径的限制以及提高前体谷氨酸的供应等方法,构建一株L-精氨酸高产的C.crenatum工程菌株。(1)根据基因同源重组原理对C.crenatum进行定向代谢改造,采用向编码6Media degenerative changes-磷酸葡萄糖异构酶pgi的基因末端添加降解标签,替selleckchem换磷酸戊糖途径的首个基因zwf的RBS结合位点,向tkt操纵子插入强启动子P_(tac)MK-1775 IC50以及叠加组合改造等策略,调控了磷酸戊糖途径的碳通量,促进辅因子NADPH的再生,并探讨对精氨酸合成的影响。与出发菌株相比,发酵效果最佳的是tkt操纵子优化菌株CCM04,经120 h摇瓶发酵后的精氨酸产量达到了17.00 g/L,提高了10.9%。(2)为进一步强化L-精氨酸合成所需的辅因子NADPH供应,利用启动子工程分别在编码异柠檬酸脱氢酶icd基因上游插入P_(eftu)和NAD激酶ppnk基因上游插入P_(sod),提高其表达水平,其中ppnk过表达的工程菌CCM07经120 h发酵后,积累的精氨酸达到18.38 g/L,较对照菌株提高了11.6%。(3)为了有效提高发酵培养基中碳、氮源的吸收转化效率,强化精氨酸合成的代谢通量,分别对ramA、ramB以及amtR等一系列全局转录调控因子进行敲除。其中敲除ramB的菌株CCM09和敲除amtR的菌株CCM10的精氨酸产量分别达到了17.66 g/L和17.98 g/L。这表明通过解除全局调控因子的抑制作用,有助于减少不必要的前体物质生成,积累共同的中间产物,推动碳氮源进一步流向L-精氨酸的合成。(4)为提高前体谷氨酸的供应,对编码磷酸化酶pknG和pknB基因进行敲除,以解除OdhI对ODHC的活化作用,使α-酮戊二酸的代谢通量向L-精氨酸合成途径转移。结果发现,pknG敲除菌株CCM11摇瓶发酵产量为20.25 g/L,有效优化了胞内谷氨酸的供应,强化了L-精氨酸的合成。最后,将组合优化的重组菌株CCM13进行摇瓶发酵,其精氨酸产量较初始菌株CCM01提高了50.35%,有效优化了菌株的发酵性能,为工业化精氨酸的生产提供参考依据。