脑作为高度分化的器官,其主要能量来源依赖于正常的线粒体功能。在衰老过程中男性血循睾酮水平下降、脑线粒体功能减弱,补充睾酮能够改善其线粒体的功能;线粒体功能的障碍常导致衰老相关的神经退行性变,研究发现线粒体功能障碍是阿尔兹海默症(Alzheimer’s disease,AD)发病过程中的早期事件之一。以认知功能障碍为主要表现的神经退行性疾病-AD的发病率逐年上升,探索AD发病过程中的风险因素、进而预防或减缓AD的发生是目前亟待解决的关键问题。基于线粒体功能障碍在AD患者发病中的作用、衰老过程中睾酮对线粒体功能的影响以及线粒体生物发生、线粒体动力学和线粒体自噬是维持线粒体稳态,保障线粒体正常功能的重要措施,推测睾酮的缺乏可能通过影响线粒体的稳态加重AD患者的线粒体功能障碍。因此,本研究以雄性APP/PS1转基因小鼠为实验对象,通过对其施予性腺切除制作睾酮缺乏动物模型,分析睾酮缺乏对海马线粒体功能的影响及其潜在机制。目的:研究睾酮缺乏对雄性APP/PS1小鼠海马线粒体功能的影响及其潜在机制。方法:1.以3月龄雄性APPswe/PSENId E9双转基因(APP/PS1)AD小鼠为研究对象。实验包括APP/PS1假手术组(APP/PS1-Sham)、APP/PS1去势组(APP/PS1-GDX)、APP/PS1去势TP补充组(APP/PS1-GDX-TP)及C57BL/6J野生型对照组(WT),共4组。深麻醉下APP/PS1-GDX和APP/PS1-GDX-TP组小鼠被施予双侧睾丸切除术。APP/PS1-GDX-TP组于去势术后1天,颈背皮下注射丙酸睾酮(Testosterone propionate,TP)1mg/(kg.day),其余各组注射等量芝麻油,每天注射一次,共注射28天。所有实验动物在前期通过水迷宫、新物体识别实验确认,与WT组相比,雄性APP/PS1-Sham小鼠存在行为学缺陷,雄性APP/PS1-GDX小鼠与APP/PS1-Sham小鼠相比行为缺陷更显著,以及通过组织化学证实APP/PS1-GDX小鼠AD病理改变的加重。2.通过JC-1染色,利用流式细胞仪分析海马线粒体膜电位水平。3.采用分光光度法检测小鼠海马线粒体ATP含量、线粒体复合物IV酶活性及柠檬酸合酶(CS)活性。4.电镜观察实验小鼠海马神经元线粒体数量及其结构的完整性。5.以实时荧光定量PCR方法,检测小鼠海马线粒体生物发生和线粒体动力学相关因子m RNA的表达水平以及线粒体DNA拷贝数。6.利用western blot分析小鼠海马线粒体相关指标的蛋白含量变化。结果:1.睾酮缺乏加重雄性APP/PS1小鼠海马线粒体的功能障碍:1.1线粒体膜电位:APP/PS1-Sham组小鼠海马的线粒体膜电位水平低于WT组小鼠(P<0.05);相对于WT组小鼠,APP/PS1-GDX组小鼠海马线粒体膜电位较APP/PS1-Sham组降低的更加明显(P<0.05);APP/PS1-GDX-TP组小鼠海马线粒体膜电位高于APP/PS1-GDX小鼠(P<0.05),达到APP/PS1-Sham组水平。1.2 ATP水平:APP/PS1-GDX组小鼠海马ATP含量显著低于APP/PS1-Sham组小鼠(P<0.01);APP/PS1-GDX-TP组小鼠海马的ATP水平高于APP/PS1-GDX组小鼠(P<0.01),未达到APP/PS1-Sham组水平;相对于WT组小鼠,APP/PS1-Sham组小鼠海马的ATP水平显示降低趋势、无明显差异。1.3selleck线粒体复合物:线粒体复合物IV的酶活性在四组之间存在着显著差异。APP/PS1-Sham组较WT组明显减弱(P<0.01);APP/PS1-GDX组比APP/PS1-Sham组减弱更加明显(P<0.01);APP/PS1-GDX-TP组较APP/PS1-GDX组复Breast biopsy合物IV的酶活性增强(P<0.01)。线粒体复合物V的酶活性仅显示WT组强于APP/PS1-Sham、APP/PS1-GDX和APP/PS1-GDX-TP(P<0.01),后三组之间无明显差异。线粒体复合物I、II、III酶活性在WT、APP/PS1-Sham、APP/PS1-GDX和APP/PS1-GDX-TP四组之间未见明显区别。2.睾酮缺乏进一步减弱雄性APP/PS1小鼠海马线粒体的生物发生:2.1柠檬酸合酶:APP/PS1-Sham组小鼠海马柠檬酸合酶(CS)的酶活性显著弱于WT组小鼠(P<0.05);APP/PS1-GDX组小鼠海马CS酶活性比APP/PS1-Sham组小鼠更弱(P<0.01)。APP/PS1-GDX-TP组小鼠海马CS酶活性显著强于APP/PS1-GDX组小鼠,未达到APP/PS1-Sham组水平(P<0.01)。2.2线粒体DNA拷贝数:与WT组相比,APP/PS1-Sham组小鼠海马的线粒体拷贝数减少(P<0.05);APP/PS1-GDX组的线粒体拷贝数比APP/PS1-Sham减少的更明显(P<0.01)。APP/PS1-GDX-TP组的线粒体拷贝数多于APP/PS1-GDX组(P<0.01)。2.3线粒体数量:APP/PS1-Sham组小鼠海马线粒体数量显著少于WT组小鼠(P<0.05);APP/PS1-GDX组小鼠海马线粒体数量比APP/PS1-Sham组小鼠更少(P<0.01)。APP/PS1-GDX-TP组小鼠海马线粒体数量显著多于APP/PS1-GDX组小鼠,达到APP/PS1-Sham组水平。此外,与WT小鼠海马线粒体显示的清晰线粒体嵴相比,APP/PS1-Sham小鼠海马的一些线粒体显示出轻微的嵴异常;APP/PS1-GDX小鼠海马线粒体损伤更明显,而APP/PS1-GDX-TP组小鼠海马线粒体嵴的结构明显优于APP/PS1-GDX组。2.4线粒体生物发生相关基因:与WT组小鼠相比,APP/PS1-Sham小鼠海马PGC-1α、NRF-1和TFAM的m RNA和蛋白质水平显著降低;APP/PS1-GDX小鼠海马PGC-1α、NRF-1和TFAM的表达进一步减少;补充睾酮逆转APP/PS1-GDX小鼠上述基因的低表达。3.睾酮缺乏进一步加重雄性APP/PS1小鼠海马线粒体动力学的失衡:与WT组小鼠相比,APP/PS1-Sham小鼠海马的Drp1在m RNA和蛋白质表达水平显著增加;APP/PS1-GDX小鼠海马Drp1的表达进一步增加;补充睾酮逆转APP/PS1-GDX小鼠Drp1的高表达。APP/PS1-Sham组小鼠海马Mfn1及OPA1的VX-661m RNA含量显著低于WT组小鼠;APP/PS1-GDX小鼠海马Mfn1及OPA1的m RNA含量进一步降低;对APP/PS1-GDX组小鼠补充TP则恢复Mfn1和OPA1的m RNA含量至APP/PS1-Sham组小鼠水平。与WT组小鼠相比,APP/PS1-Sham组小鼠海马Mfn1蛋白表达水平呈现降低趋势;APP/PS1-GDX小鼠Mfn1的蛋白表达显著降低。OPA1的蛋白表达水平在WT、APP/PS1-Sham、APP/PS1-GDX和APP/PS1-GDX-TP四组小鼠之间表现出与其m RNA相似的规律,但OPA1的蛋白水平仅显示WT组强于APP/PS1-GDX组。4.睾酮缺乏进一步降低雄性APP/PS1小鼠海马线粒体自噬能力:与WT对照组小鼠组比较,APP/PS1-Sham组小鼠海马PINK1和Par kin蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。APP/PS1-GDX处理组小鼠PINK1的蛋白表达水平显著低于APP/PS1-Sham组小鼠(P<0.01);APP/PS1-GDX-TP组高于APP/PS1-GDX组(P<0.01)、达到APP/PS1-Sham组小鼠水平。相对于APP/PS1-Sham组小鼠,Parkin的蛋白表达水平在APP/P S1-GDX组小鼠呈现降低趋势。结论:1.睾酮缺乏加重雄性APP/PS1小鼠海马的线粒体功能障碍。2.由睾酮缺乏所加剧的雄性APP/PS1小鼠海马线粒体功能障碍与睾酮缺乏改变其线粒体生物发生、线粒体动力学及线粒体自噬所致的线粒体稳态失衡有关。