近年来,随着对固有免疫深入研究发现脊椎动物和无脊椎动物固有免疫均存在适应性,在脊椎动物被称为训练免疫,在无脊椎动物中则被称为免疫致敏。但对于免疫致敏的发生机制并未进行全面研究。实验室前期研究发现一些机制可能在长牡蛎的免疫致敏中扮演着重要角色,如吞噬作用。本研究以长牡蛎(Crassostrea gigas)为实验材料,探究脾酪氨酸激酶(Spleen tyrosine kinase,Syk)和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian Target of Rapamycin,m TOR)在免疫致敏中对无氧糖酵解途径和自噬的调控作用,取得以下结果:1.Cg Syk通过诱导自噬相关基因表达和Cg LC3切割调节血淋巴细胞自噬Cg Syk基因全长为4566 bp,开放阅读框为1989 bp,编码662个氨基酸的多肽。Cg Syk包含两个SH2结构域和一个Tyr Kc结构域。选择13个来自不同物种的Syks进行系统发育分析,结果显示与无脊椎动物亲缘关系较近划为一支,同时与美洲牡蛎的Cv Syk聚为一类。采用RNA干扰技术干扰Cg Syk的表达后,在灿烂弧菌(Vibrio splendidperformance biosensorus)刺激12小时后,采用实时荧光定量PCR技术(Quantitative real-time PCR,q RT-PCR)检测血淋巴细胞中Cg LC3、Cg P62、Cg Beclin-1和Cg ATG5的m RNA的表达水平。结果显示当干扰Cg Syk的表达后,Cg LC3、Cg P62、Cg Beclin-1和Cg ATG5的m RNA表达水平在灿烂弧菌刺激12小时后与EGFP-RNAi对照组相比显著降低(p<0.05)。利用蛋白质免疫印迹(Western Blot)分析Cg LC3的切割情况,结果发现当干扰Cg Syk的表达后,Cg LC3Ⅱ/Cg Tubulin的比例在灿烂弧菌刺激12小时后与EGFP-RNAi对照组相比降低。同时血淋巴细胞自噬率也显著降低,进一步分析Cg Syk对血淋巴细胞中三种类群细胞自噬率的影响。结果发现当干扰Cg Syk的表达后,三种类群血淋巴细胞的自噬率在灿烂弧菌刺激12小时后均下降,且半颗粒细胞自噬率显著下降(p<0.05)。以上结果表明Cg Syk通过调控自噬相关基因的表达和Cg LC3切割来调节血淋巴细胞自噬从而在长牡蛎血淋巴细胞抗菌免疫中发挥作用。2.Cgm TORCL 318952体内通过诱导自噬相关基因表达和Cg LC3切割调节血淋巴细胞自噬Cgm TOR基因全长为7802bp,编码2483个氨基酸的多肽。Cgm TOR包含一个Pfam HEAT结构域、DUF3385结构域、Pfam FAT结构域、RapamycinBelumosudil半抑制浓度＿bind结构域、结构域PI3Kc结构域和一个FATC结构域。利用m TOR抑制剂Rapamycin(Rap)处理长牡蛎,采用q RT-PCR检测V.splendidus刺激12小时后,血淋巴细胞中Cg LC3、Cg P62、Cg Beclin-1和Cg ATG5的m RNA表达变化。结果显示当抑制Cgm TOR活性后,Cg LC3、Cg P62、Cg Beclin-1和Cg ATG5的m RNA表达水平在灿烂弧菌刺激12小时后与DMSO对照组相比显著升高(p<0.05)。利用Western Blot分析Cg LC3的切割情况,结果发现当抑制Cgm TOR活性后,Rap组与DMSO对照组相比Cg LC3Ⅱ的表达升高,上述结果表明Cgm TOR通过抑制自噬相关基因的表达以及Cg LC3切割调控灿烂弧菌刺激诱导的长牡蛎血淋巴细胞自噬。3.免疫致敏中Cg Syk和Cgm TOR对无氧糖酵解途径的调控采用RNAi技术干扰Cg Syk的表达以及使用Rap抑制Cgm TOR活性后,用灿烂弧菌对长牡蛎进行第一次免疫刺激6小时后,检测葡萄糖转运体蛋白(Glucose Transporters,Glu T)、葡萄糖激酶(Glucokinase,Gk)和己糖激酶(Hexokinase,Hk)的变化。结果发现干扰Cg Syk表达以及Rap处理后Cg Gk和Cg Hk的m RNA表达水平显著降低(p<0.05)。Cg Syk的表达被抑制,一次刺激7天后Cg Glu T的m RNA表达水平显著降低(p<0.05);Rap处理,一次刺激7天后Cg Glu T、Cg Gk和Cg Hk的m RNA表达水平升高。Cg Syk的表达被抑制,二次刺激6小时后Cg Gk的m RNA表达水平显著降低(p<0.05);Rap处理,二次刺激6小时后Cg Glu T的m RNA表达水平显著降低(p<0.05)。上述结果表明Cg Syk和Cgm TOR能够在免疫致敏中调控无氧糖酵解途径为免疫应答提供能量。4.免疫致敏中Cg Syk和Cgm TOR对自噬相关基因的调控采用RNAi技术干扰Cg Syk的表达和利用Rap抑制Cgm TOR活性后,再用灿烂弧菌对长牡蛎进行一次免疫刺激6小时,7天和二次免疫刺激6小时后,用q RT-PCR检测自噬相关基因的表达情况。结果显示当干扰Cg Syk的表达,Cg LC3、Cg P62、Cg Beclin-1和Cg ATG5的m RNA表达水平在灿烂弧菌刺激6小时、7天和二次刺激6小时后与EGFPRNAi对照组相比显著降低(p<0.05)。Rap处理后,长牡蛎血淋巴细胞中Cg LC3、Cg P62、Cg Beclin-1和Cg ATG5的m RNA表达水平在灿烂弧菌刺激6小时后与DMSO对照组相比上调,在7天时自噬相关基因的m RNA表达水平显著降低(p<0.05);二次刺激6小时后,Cg LC3、Cg P62和Cg Beclin-1的m RNA表达水平显著升高(p<0.05)。上述结果表明免疫致敏中Cg Syk和Cgm TOR能调控自噬相关基因的表达调节体内的自噬。综上所述,本研究发现Cg Syk和Cgm TOR通过调节自噬相关基因Cg LC3,Cg P62,Cg Beclin-1和Cg ATG5的表达参与病原菌诱导的血淋巴细胞自噬;发现在免疫致敏中Cg Syk和Cgm TOR可以调控自噬相关基因的表达,同时参与调控无氧糖酵解途径。相关研究加深了对无脊椎动物免疫致敏机制的认识。