【研究背景】神经退行性疾病是一类以神经元结构和功能进行性丧失导致神经元最终死亡为主要特征的疾病。氧化应激(Oxidative stress,OS)是神经退行性病变的重要早期事件,OS可导致脂质过氧化、DNA损伤、代谢紊乱及线粒体功能障碍,启动细胞凋亡相关信号通路,引发神经元死亡。花生四烯酸(Arachidonic acid,AA)是细胞中一种多不饱和脂肪酸,在脑功能调节中发挥重要作用。近期研究发现,细胞内AA含量急剧增NSC 119875作用加与OS激活p38、MAPK及JNK通路相关的细胞损伤和神经退行性病变密切相关。因此,AA及其代谢途径在OS诱导细胞损伤和神经退行性变中发挥着重要作用。花生四烯酸脂氧合酶-3(Arachidonate lipoxygenase 3,ALOXE3)是AA代谢途径中的关键酶。我们之前研究表明,ALOXELGK-974配制3在小鼠海马组织中丰量表达,且过表达ALOXE3可显著降低细胞内AA水平,然而,ALOXE3是否通过下调AA含量来缓解OS致神经细胞损伤,目前还未见报道。【研究目的】本研究通过分析ALOXE3过表达在H_2O_2诱导海马神经元氧化应激及细胞损伤中的影响,揭示ALOXE3发挥神经保护作用的潜在途径,为探索神经退行性疾病的诊治措施提供新的依据。【研究方法】1、不同浓度H_2O_2处理培养的海马HT22细胞,采用CCK-8试剂盒检测细胞活力、采用ROS分析试剂盒测定细胞内ROS水平及Elisa法测定细胞内AA含量,确定后续实验的最佳H_2O_2处理浓度。2、不同浓度AA处理HT22细胞,检测细胞活力及细胞内ROS含量,确定AA处理细胞的合理浓度。3、根据前面实验结果选用合适浓度的H_2O_2及AA分别处理HT22细胞,然后用Western blot和RT-q PCR实验分析ALOXE3、SOD1和SOD2蛋白及其m RNA的表达变化情况。4、构建Aloxe3基因过表达质粒,采用脂质体转染法在HT22细胞过表达ALOXE3,并且分别用适合浓度的H_2O_2或AA处理细胞,然后采用分析细胞活力及细胞内ROS水平,Western blot检测ALOXE3、SOD1及SOD2的表达改变情况。5、进一步采用Western blot检测上述处理的HT22细胞中MAPK通路关键蛋白(ERK1/2、p38及JNK)磷酸化修饰的变化情况。【研究结果】1、H_2O_2或AA处理诱导HT22细胞氧化应激及细胞损伤采用0-500μM浓度梯度H_2O_2处理HT22细胞的研究结果显示,细胞活力随着H_2O_2剂量增加而逐渐降低,细胞内ROS及AA水平逐渐升高;与对照组相比,在H_2O_2浓度增加至200μM时,上述指标发生显著性变化,表明200μM可作为H_2O_2诱导该细胞株氧化应激致细胞损伤的合理浓度。另外,选取0-50μM浓度梯度AA处理该细胞发现,细胞活力随着外源性AA处理剂量增加而逐渐下降,细胞内ROS水平逐渐升高;与对照相比较,在AA处理浓度达到20μM时细胞活力开始显著性下降,ROS在AA浓度升至10μM时显著上升。上述结果表明H_2O_2或AA处理可导致HT22细胞氧化应激及细胞损伤。2、H_2O_2或AA处理导致HT22细胞SOD2与ALOXE3表达下调为了探索氧化应激与AA代谢之间的关系,本研究进一步分析H_2O_2或AA处理条件下氧化应激相关酶SOD及AA代谢酶ALOXE3表达情况。结果显示,在不同浓度H_2O_2(200μM、500μM)或AA(20μM、50μM)处理条件下,SOD2蛋白及m RNA水平呈现浓度依赖性显著下调,但SOD1蛋白及m RNA水平表达没有显著变化;另外,ALOXE3蛋白及m RNA水平也呈现浓度依赖性显著下调。由此可见,外源H_2O_2或AA处理均可导致SOD2及ALOXE3表达下调。3、过表达ALOXE3可减轻H_2O_2或AA所致氧化应激及细胞损伤进一步在H_2O_2或morphological and biochemical MRIAA处理HT22细胞同时过表达ALOXE3,分析ALOXE3是否在H_2O_2或AA诱导氧化应激及细胞损伤中发挥保护作用。与对照组相比,H_2O_2(200μM)或AA(20μM)处理组的细胞活力显著下降,细胞内ROS水平显著升高;与H_2O_2或AA处理组相比较,过表达ALOXE3可显著增强细胞活力,下调ROS水平。上述结果表明,ALOXE3过表达可缓解H_2O_2或AA所致的氧化应激状态及细胞活力下降。4、ALOXE3过表达逆转H_2O_2或AA致SOD2表达下调为了探究ALOXE3过表达发挥神经保护的作用的可能原因,本研究分析H_2O_2或AA联合ALOXE3过表达条件下抗氧化应激酶SOD1与SOD2的表达情况。结果显示,与对照组比较,H_2O_2或AA处理组SOD2表达显著下调,但SOD1表达无显著改变;与H_2O_2或AA处理组比较,过表达ALOXE3显著上调SOD2表达,而SOD1表达也无显著变化。因此,ALOXE3过表达很可能是通过恢复SOD2表达来发挥抗氧化应激致神经细胞损伤。5、过表达ALOXE3缓解H_2O_2或AA致MAPK通路激活既往证据证实MAPK通路的激活在氧化应激致神经损伤过程中发挥重要作用,由此推测ALOXE3过表达很可能通过抗氧化应激来抑制MAPK通路激活。本研究Western blot分析结果显示,与对照组相比,H_2O_2或AA处理细胞中MAPK通路关键成员p-ERK/ERK、p-p38/p38、p-JNK/JNK相对比值显著上调;与H_2O_2或AA处理组比较,过表达ALOXE3细胞中p-ERK/ERK、p-38/38、p-JNK/JNK相对比值显著下调。上述结果表明,ALOXE3过表达可缓解H_2O_2或AA所致的MAPK通路激活,从而减轻氧化应激致神经细胞损伤。【结论】本研究表明在H_2O_2和AA诱导氧化应激状态可导致ALOXE3表达下调,而ALOXE3过表达可以恢复H_2O_2和AA诱导的细胞活力下降及SOD2下调,SOD2表达恢复可缓解氧化应激,进一步抑制MAPK通路激活,最终减轻氧化应激致神经元损伤。研究结果提示ALOXE3可能是氧化应激相关神经退行性疾病的潜在干预靶点。