【背景】认知,是指人们获得知识,应用知识的,或信息加工的过程,这是人最基本的心理过程。它包括感觉、知觉、记忆、思维、想象和语言等。人脑接受外界信息的输入,经过大脑的加工处理,转换成内在的心理活动,进而支配人的行为,这个过程就是信息加工的过程,也就是认知过程。研究表明,长期生活在高原、潜艇等特殊环境下的军人会出现一定程度的认知障碍。如射击作为官兵技能与战术、速度与时间深度契合的一种军事能力体现广受认知功能影响,高原官兵较低海拔组,反应时间明显延长,目标追踪速度显著下降,射击成绩整体水平随之下降~([1])。改善军人认知功能障碍,有助于提升军人战斗力水平,提高军人作战能力。而以阿尔兹海默症为代表的神经退行性疾病,通常会伴随不同程度的认知障碍。目前,随Docetaxel体外着寿命增加,老年人口数量快速攀升,神经退行性疾病等慢性病发病率进一步加剧,严重危害老年人的身心健康并影响生存质量,给病人造成深重的痛苦,给家庭及社会带来沉重的负担,已成为严重的社会问题。因此阐明认知障碍的机制,建立干预技术对提升官兵作战效能及减轻神经退行性疾病患者痛苦具有重要意义。星形胶质细胞(Astrocyte,AST)作为哺乳动物大脑中最大的胶质细胞,占整个大脑胶质细胞的20%-40%,是中枢神经系统(Central nervous system,CNS)发育和功能所必需的~([2])。然而,和神经元相比,星形胶质细胞由于缺少特定的标记和操作工具,其许多特点仍然是未知的。近年来的研究表明,星形胶质细胞参与了中枢神经系统中的很多功能,例如参与突触形成~([3]),维持细胞内外离子浓度的恒定~([3]),参与神经递质的传递~([4]),形成并维持血脑屏障~([5])。星形胶质细胞能够与突触和神经元相互作用,形成“三方突触”~([6]),在突触加工等方面发挥着积极的作用,但在病理条件下,星形胶质细胞-神经元相互作用可能发生剧烈变化,对支持记忆形成和认知功能的脑回路产生强烈影响。尽管星形胶质细胞的作用机制还没有完全阐明,但许多研究已经阐明了星形胶质细胞确实参与了认知过程。以阿尔兹海默症(Alzheimer’s disease,AD)为例,对死后AD脑组织分析表明,反应性星形胶质细胞聚集在Aβ沉积物周围。与小胶质细胞类似,在暴露于Aβ后,星形胶质细胞极化为A1状态,随后释放细胞因子(如IL-1β或IL-6)、一氧化氮、活性氧和过量谷氨酸~([7,8])。这一系列的神经毒性或兴奋性毒性最终tubular damage biomarkers演变为神经元丢失和神经变性。此外,在星形胶质细胞中发现BACE1的表达,这表明星形胶质细胞可能参与Aβ聚集~([9])。为了确定星形胶质细胞中Aβ的来源,Veeraraghavalu等~([10])从新生PS1ΔE9flox或APPswe小鼠以及8周龄APPswe/PS1ΔE9flo小鼠的大脑中分离出原代星形胶质细胞,他们在培养基中检测到星形胶质细胞分泌的Aβ的表达。AD的进展中可以观察到神经元-星形胶质细胞乳酸穿梭损伤~([11])。最近的一项研究表明,APP/PS1小鼠的皮层和海马中MCT(MCT1、MCT2和MCT4)和乳酸相关酶(乳酸脱氢酶A)的表达减少~([12])。Suzuki等~([12,13])还报道,MCT1、MCT2或MCT4表达的破坏会损害突触可塑性和长期记忆,而星形胶质细胞和神经元之间乳酸转运的恢复可以挽救这些缺陷。Jung等~([13])表明,星形胶质细胞产生的ATP可防止Aβ病理过程中的神经元可塑性损伤和树突棘丢失。此外,星形细胞介导的神经炎症与AD有关。减轻腺相关病毒导致的星形胶质细胞激活可改善Aβ病理状态,调节突触可塑性,并改善AD模型小鼠的认知障碍~([14])。另一方面,Katsouri等~([14])证明,星形胶质细胞的消融会增加Aβ水平,影响突触和神经元密度,并诱导小鼠记忆缺陷。这些研究表明星形胶质细胞在包括AD在内的炎症相关疾病中起着至关重要的作用。维持正常的星形胶质细胞功能并减少其激活可能会预防AD的发生。Mysm1,属于金属蛋白酶家族,具有去泛素化酶催化活性。有SANT、SWIRN以及MPN三个结构域~([15])。Mysm1在造血干细胞、淋巴细胞和成熟血细胞中具有重要作用。2011年Jiang等~([16])发现,Mysm1对于B细胞早期发育起着非常重要的作用,Mysm1的缺乏会导致早期B细胞谱系定向分化受阻,EBF1和其他B淋巴细胞的基因表达受到抑制。2013年Nandakumar等~([17])发现,Mysm1在NK细胞的成熟方面发挥着巨大的作用,Mysm1~(-/-)NK细胞从表型上看是不成熟的,但是NK细胞的谱系定向却是正常的,即NK细胞的分化不受影响。2014年Won等~([18])发现,Mysm1对树突状细胞(DC)的生长发育、骨髓祖细胞分化为树突状细胞中发挥重要作用,且对FLT3L所诱导的早期造血前体DC的形成具有选择性作用。2015年Gekara等~([19])人发现,Mysm1作为天然免疫的一种关键调节器,可以通过抑制模式识别受体(PRRs)通路从而防止过度的免疫反应。2016年Li等~([20])发现,Mysm1在MSC的维持和分化中起着至关重要的作用。Mysm1可能作为调控MSC谱系分化的潜在治疗靶标,并可能用于治疗代谢性骨疾病(如骨质疏松症)等。2017年F?rster等~([21])发现,Mysm1在调控T细胞的细胞活化、增殖、细胞因子产生和细胞凋亡中发挥重要作用,并且维持外周CD8+T细胞的数量。2020年,Tian等~([22])发现Mysm1通过c GAS-STING通路抑制先天免疫和自身免疫,可以抑制系统性红斑狼疮。2021年,Tian等~([23])研究表明Mysm1可以通过促进DNA修复延缓衰老。课题组前期研究结果表明,Mysm1和小鼠星形胶selleck产品质细胞存在明显的共定位,而神经炎症导致的认知障碍小鼠其海马区Mysm1表达升高;同时敲低Mysm1可以通过调节ATP的表达缓解小鼠的抑郁样行为。因此本课题将主要探究Mysm1对星形胶质细胞代谢功能的影响及其在认知调控中的作用。【目的】探究Mysm1对星形胶质细胞代谢功能的影响及其在认知调控中发挥的作用【方法】1.通过免疫组织化学染色观察人脑中Mysm1表达;通过免疫荧光染色检测不同年龄小鼠脑组织中Mysm1表达;Western blot和实时荧光定量PCR检测年轻及老年鼠脑组织中Mysm1表达以及实时荧光定量PCR检测衰老基因、糖酵解基因和参与氧化应激调节的相关基因表达;通过开放旷场实验、水迷宫实验评价小鼠的认知功能。2.体外构建炎症及衰老模型,通过线粒体膜电位检测试剂盒检测线粒体膜电位;O2K能量代谢分析仪检测细胞耗氧率。通过ATP检测试剂盒检测细胞ATP含量;氧化应激检测试剂盒检测细胞氧化应激水平;超氧化物阴离子荧光探针检测ROS含量;使用过氧化氢刺激转入对照(sh Ctrl)及敲低Mysm1病毒(sh Mysm1)的星形胶质细胞,通过超氧化物阴离子荧光探针检测ROS含量;通过透射电镜观察线粒体的形态、结构和数量。3.将转入对照(sh Ctrl)及敲低Mysm1病毒(sh Mysm1)的星形胶质细胞进行转录组学、蛋白质组和代谢组学分析,通过测序结果分析敲低Mysm1对星形胶质细胞的影响;Western blot检测Mysm1可能调控星形胶质细胞的信号通路同时通过关键通路分子抑制剂验证其发挥的作用;Co-IP检测与Mysm1相互作用的蛋白,明确Mysm1调控星形胶质细胞代谢功能的机制。【结果】1.认知障碍模型海马区Mysm1表达升高免疫组织化学染色结果显示老年人和AD患者海马组织中Mysm1表达明显升高;免疫荧光染色结果表明Mysm1在老年鼠和AD模型小鼠中表达升高。同时实时荧光定量PCR和Western blot检测8周龄和48周小鼠海马组织中Mysm1表达水平,结果表明48周龄小鼠海马组织中Mysm1水平明显高于8周龄小鼠。2.认知障碍小鼠表现出代谢紊乱对年轻和老年鼠进行行为学评价分析,开放旷场实验表明年轻小鼠和老年鼠在运功能力方面没有太大差异;水迷宫实验结果表明学习期老年鼠找到隐藏平台的时间更长同时测试期穿越隐藏平台次数较少。实时荧光定量PCR结果表明老年鼠衰老基因、炎性因子、糖酵解关键酶相关基因表达升高。3.敲低Mysm1能够改善老年鼠的认知障碍实时荧光定量PCR检测病毒敲低效率;开放旷场实验结果表明对照组(AAV-CON组)与敲低Mysm1组(AAV-GFAP-Cre组)小鼠运动能力没有明显差异;水迷宫实验显示AAV-sh Mysm1组小鼠在学习期找到隐藏平台的时间更短同时在测试期找到平台的次数更多,说明小鼠认知功能得到改善。实时荧光定量PCR结果表明AAV-GFAP-Cre组氧化应激相关基因表达降低。4.体外构建衰老及炎症模型,导致星形胶质细胞出现代谢障碍在体外,分离原代星形胶质细胞,在P3代给予细胞50μM H_2O_2刺激2小时,之后再培养48小时构建衰老模型;对细胞给予40 ng/m L TNF-α+10 ng/m L IL-1β刺激24小时构建炎症模型。线粒体膜电位检测试剂盒检测发现刺激后星形胶质细胞线粒体膜电位降低;对细胞耗氧率检测发现刺激后细胞耗氧率明显降低。5.敲低Mysm1后星形胶质细胞线粒体功能增强ATP检测结果显示和对照组(sh Ctrl组)相比,敲低Mysm1组(sh Mysm1组)细胞胞内ATP含量更高;同时检测细胞内乳酸含量结果表明sh Mysm1组细胞中乳酸含量较低;而实时荧光定量PCR和Western blot检测参与糖酵解的关键酶(GLUT1、G6PD、PKM2、LDHA和MCT4)表达,发现sh Mysm1组大部分关键酶的表达都明显降低。而通过柠檬酸合酶(CS)检测试剂盒检测了胞内CS含量,发现sh Mysm1组内CS含量有一定程度升高。Western blot结果显示sh Mysm1组Tomm20和COX IV表达升高,Mito-tracker荧光标记sh Mysm1组显示荧光强度更强说明其线粒体含量更多。因此,Mysm1可能在调控星形胶质细胞线粒体上发挥作用。6.敲低Mysm1后能够改善外界刺激导致的氧化应激水平升高和线粒体损伤检测sh Ctrl组和sh Mysm1组细胞中SOD、GSSG、MDA含量,发现在sh Mysm1组细胞中SOD和GSSG含量升高而MDA含量下降,同时通过超氧化物阴离子标记两组细胞,结果表明两组细胞间的超氧化物阴离子荧光强度没有差异,说明敲低Mysm1后星形胶质细胞氧化应激水平降低。对细胞给予H_2O_2刺激后检测星形胶质细胞超氧化物阴离子,结果发现sh Mysm1+H_2O_2超氧化物阴离子含量低于sh Ctrl+H_2O_2组。同时炎性刺激后通过电镜观察线粒体数量和形态,发现sh Mysm1组在刺激后线粒体结构和形态明显好于sh Ctrl组。7.组学结果显示敲低Mysm1后星形胶质细胞代谢相关分子发生变化将sh Ctrl组和sh Mysm1组细胞做转录组学,蛋白质组和代谢组学检测,转录组学显示敲低Mysm1后参与线粒体呼吸链组成的基因表达升高;蛋白质组结果显示sh Mysm1组呼吸链复合体相关蛋白有较明显的升高,同时分子变化主要集中在氧化磷酸化、TCA循环和AMPK通路等;代谢组学结果显示sh Mysm1组糖酵解关键分子含量降低而TCA循环相关分子含量升高,同时涉及糖酵解、TCA循环等代谢分子的变化明显。8.Mysm1和p53相互作用激活p53-AMPK通路促进线粒体发生Western blot检测AMPK及其上下游分子变化,结果表明p-AMPK表达升高,同时其上游p-p53和下游Sirt1和PGC1α表达升高。之后在细胞中加入p53抑制剂和AMPK抑制剂,结果发现两种抑制剂能够抑制由Mysm1敲低引起的ATP升高;Co-IP检测结果表明Mysm1和p53存在相互作用。【结论】(1)老年人及老年鼠海马区Mysm1表达升高,而敲低老年鼠Mysm1后小鼠氧化应激水平降低,认知障碍改善。(2)敲低Mysm1后,星形胶质细胞线粒体功能增强,能够降低外界刺激导致的线粒体损伤和氧化应激水平升高。(3)Mysm1通过和p53相互作用调控p53-AMPK通路