目的评价结核分枝杆菌(M.tb)Ag85B-Fc融合蛋白滴鼻免疫过敏性哮喘(AA)模型小鼠的疗效,采用转录组和蛋白组学联合分Research Animals & Accessories析初步探究Ag85B蛋白干预AA的机制。方法1.Ag85B-Fc融合蛋白的分离纯化:将稳定表达Ag85B-Fc的中国仓鼠卵巢细胞(CHO)进行大量扩增培养,收集细胞上清后经蛋白G琼脂糖凝胶分离纯化Ag85B-Fc融合蛋白;采用Western-Blot鉴定Ag85B-Fc融合蛋白的表达情况、采用考马斯亮蓝检测Ag85B-Fc融合蛋白的纯度。2.AA模型制备及Ag85B-Fc融合蛋白滴鼻免疫:将24只6-8周龄C57BL/6J雌鼠随机分为Normal组、OVA组、Cp G组和Ag85B-Fc+Cp G组,每组6只;除Normal组外,其余3组于前2周分3次腹腔注射致敏药物(氢氧化铝与OVA),每次间隔7天;在第15、22天进行2次滴鼻免疫;第29-34使用OVA雾化发敏,每天20min;第34天收集小鼠血液、肺泡灌洗液、肺和主要器官(心、肝、脾、肾)。3.疗效评价:(1)采用HE染色法评估气道周围炎症细胞浸润情况、以及分析Ag85B-Fc融合蛋白对机体主要器官是否产生病理损伤;(2)采用糖原染色(PAS)观察小鼠气道粘液分泌和柱状上皮细胞增生情况;(3)采用流式细胞术检测小鼠肺组织中嗜酸性粒细胞、M1巨噬细胞、M2巨噬细胞、Th1、Th2的占比;(4)采用ELISA检测血清与肺泡灌洗液中Ig E、IFN-γ、IL-4及IL-13的水平。4.机制研究AY-22989试剂:(1)采用转录组学与蛋白组学联合分析,筛选受Ag85B影响的关键通路、以及受Ag85B调控的核心基因和蛋白;(2)采用Western-Blot技术与IF(免疫荧光法)验证被筛选的部分核心蛋白在肺组织中的表达情况。结果1.疗效评价:(1)获得了高纯度的Ag85B-Fc融合蛋白;(2)HE结果显示,与OVA组相比,Ag85B-Fc组气道周围炎症细胞浸润明显减轻,Cp G组气道周围仍有大量炎症细胞浸润;与Normal组相比,Ag85B-Fc组主要器官(心、肝、脾、肾)无组织病理学变化;(3)PAS结果显示,与OVA组相比,Ag85B-Fc组气道粘液分泌减少,杯状细胞增生减轻,Cp G组改变不明显;(4)ELISA结果显示,与OVA组相比,Ag85B-Fc组肺泡灌洗液与血清中Ig E、IL-4、IL-13水平降低(P<0.05),IFN-γ水平升高(P<0.05),Cp G组Ig E、IL-4、IL-13、IFN-γ水平无显著变化;(5)流式细胞术检测结果显示,与OVA组相比,Ag85B-Fc组肺组织中嗜酸性粒细胞数量减少(P<0.05),Th1细胞数量增加(P<0.05),Th2细胞数量减少(P<0.05),M1型巨噬细胞数量无显著变化,M2型巨噬细胞细胞数量减少(P<0.05),Cp G组各类细胞无显著变化。以上数据表明Ag85B-Fc融合蛋白滴鼻Nirogacestat免疫对AA小鼠的疗效显著。2.机制研究:(1)转录组与蛋白组学联合分析结果显示,受Ag85B蛋白调控的基因和蛋白主要富集在补体和凝血级联反应、吞噬体信号通路。Itgam(CD11b,整合素αM)、Itgb2(CD18,整合素α2B)、C3ar1(C3a R1,补体C3a受体1)、fgg(FGG,纤维蛋白原γ)、Cybb(CYBB,NADPH氧化酶1)及Ncf4(NCF4,NADPH氧化酶调节亚基)被确定为受Ag85B调控的核心靶点,其中CD11b和CD18是补体CR3的两个亚基,C3a R1是过敏毒素C3a的受体;Western-Blot和免疫荧光(IF)验证结果与联合分析结果一致。以上数据表明,Ag85B减轻AA的机制与其下调补体与凝血级联途径、吞噬体信号通路中CR3及C3a R1介导的信号活化相关。结论结核分枝杆菌Ag85B-Fc融合蛋白滴鼻免疫对卵清蛋白(OVA)诱导的小鼠AA疗效显著,且对主要器官未产生病理损伤;Ag85B减轻AA的机制与其下调补体与凝血级联途径、吞噬体信号通路中CR3及C3a R1介导的信号活化相关;Ag85B-Fc融合蛋白有望成为过敏性哮喘的鼻黏膜免疫治疗剂。