偶氮染料和抗生素是两种典型的难降解新型污染物,其废水在环境中的大量排放和迁移对生态系统造成严重危害。相比于物理化学方法,微生物降解技术在有机物废水处理中显示出巨大的潜力,尤其是真菌介导的生物降解,由于其能够分泌多种非特异性的氧化酶,在难降解有机物的降解处理方面,相比于细菌降解更具有优势。真菌在降解偶氮染料过程中,不会累积形成有毒的中间产物苯胺,对抗生素进行降解时,不易引起抗性基因的传播。目前,关于偶氮染料和抗生素的真菌降解主要是丝状真菌的好氧降解。虽然丝状真菌能够分泌厌氧代谢相关的酶,并可能存在高效的厌氧降解能力,但极少有相关的研究证实,关于其厌氧降解机制的研究更是没有。本文筛选得到可以厌氧降解偶氮染料与抗生素的烟曲霉Aspergillus tabacinus LZ-M,发现其可以完全矿化两种有机物,说明其具有高效的降解能力。因此,在此基础上,本文以Aspergillus tabacinus LZ-M为研究对象,以酸性红73(AR73)和甲硝唑(MNZ)为模式污染物,分BLZ945体外析了LZ-M对这两种有机物的厌氧降解效果;利用代谢组学分析了其降解通路;结合基因组学、比较转录组学和蛋白组学揭示了其降解机理;并通过固定化生物强化技术探索了LZ-M菌在城市废水处理中的应用潜力。具体研究结果如下:(1)降解能力分析试验发现:LZ-M在好氧条件生长,厌氧条件下分解葡萄糖产生CO_2,并有效降解不同染料和抗生素。其对400 mg/L AR73、400 mg/L的甲基橙、200 mg/L的中性红和30 mg/L孔雀石绿的降解率分别为90.28%、86%、87%和63.23%;对5 mg/L MNZ、10 mg/L呋喃唑酮和10 mg/L 3,5-二硝基水杨酸的降解率分别为75.02%、87.17%和68.13%。结果表明,LZ-M的厌氧降解能力明显优于其在好氧培养时的降解能力。(2)在(1)的基础上,对AR73的代谢产物利用LC-MS进行代谢组学分析发现:AR73先水解成2-羟基萘和N-苯基亚硝酰胺,随后矿化成CO_2。在降解过程中,电子转移引起了碳氧化和氮还原,揭示了AR73通过自氧化还原过程进行完全矿化,首次揭示了偶氮染料的新的降解机制。碳平衡和电子平衡分析表明,AR73中有31.8%的碳可以通过LZ-M菌的厌氧作用矿化并转化为CO_2。(3)对AR73降解的比较转录组学分析显示:差异表达基因中,参与芳香族降解、糖酵解、细胞色素C和醌氧化还原酶相关基因表现出高的转录水平和显著上调,进一步说明AR73降解产生的芳香类化合物通过儿茶酚通路和糖酵解过程矿化产生CO_2。而关键的脱色酶,即将AR73分解成2-羟基萘和N-苯基亚硝酰胺的水解酶基因并没有被发现。同时,在上调基因中未知基因占比59.23%,说明了大量功能未知蛋白的存在。进一步对这些未知基因进行克隆,发现了具有显著的AR73脱色能力的新水解脱色蛋白Ord95,以NADH为电子供体。通过产物鉴定,该酶可将AR73裂解为2-羟基萘和N-苯基亚硝酰胺,这与LZ-M的降解产物一致。说明Ord95为LZ-M进行AR73降解的关键脱色酶。通过SWISS-MODEL结构分析,该酶包含一个谷氧还蛋白结构域。通过点突变实验检确定38R、54R和55R是该结构域中的关键活性位点。(4)对MNZ的降解产物进行LC-MS分析表明:MNZ在降解中发生了-C-C-键断裂、-C-N-键断裂和羟基化,最后生成乙炔和尿素。对其菌胞内代谢物的代谢组学分析发现,氨基酸代谢通路中的代谢物显著上调,且其参与的转化反应与水解酶、转氨酶和氧化还原酶有关。(5)对MNZ降解的比较转录组学分析结果显示:在差异表达PD-0332991基因中,转氨酶、甲基转移酶、单加氧酶、-C-N-裂解酶和水解酶相关基因显著上调。这些酶可能是参与MNZ降解中断裂-C-C-、-C-N-和羟基化的关键酶。进行蛋白组学分析也发现这些酶在LZ-M中进行了高表达。说明LZ-M利用分泌的转氨酶、甲基转移酶、单加氧酶、-C-N-裂解酶和水解酶,通过-C-C-和-C-N-的断裂和羟基化对MNZ进行降解。(6)利用固定化生物强化技术,对LZ-M在MNZ废水厌氧处理中的进一步应用发现:将LZ-M菌通过海绵进行固定,然后添加到厌氧活性污泥系统中进行生物强化实验时,可以增加LZ-M菌在活性污泥系统中的存活率。同时,以海绵作为载体,LZ-M菌能与活性污泥在海绵孔隙中共存。经固定化生物强化后,系统能有效去除废水中的MNZ,对COD的去除率增加了7.12倍,产气量增加了6.14倍。此外,生物强化减轻了MNZ对活性污泥的毒性作用,促进了其代谢和生长,并保护了活性污泥的微生物群落免受MNZ的侵害。通过nim基因检测发现MNZ能够引起AD系统中抗性基因的增加,而Cross infection生物强化作用减少了该抗性基因的丰度。这些结果表明:在存在MNZ污染的情况下,利用固定化LZ-M的生物强化是保护厌氧活性污泥系统的有效方法。本研究从土壤中获得的曲霉真菌LZ-M可高效降解多种偶氮染料和抗生素类新型污染物,同时进行了关键降解酶与基因的挖掘。研究为偶氮染料和抗生素的真菌降解提供了新的微生物资源和研究思路;同时,对真菌在抗生素废水处理中的应用和对抗性基因的治理提供了新的方法。