血淋巴细胞作为重要的免疫细胞,在无脊椎动物的免疫防御中发挥至关重要的作用。在机体应对病原入侵的免疫应答过程中,血淋巴细胞发生大量增殖,细胞数量快速增加以有效清除病Xanthan biopolymer原,但其具体调节机制仍不明确。已有研究表明,Wnt信号通路不仅在调节多细胞动物的胚胎发育如体轴形成、器官发生等过程中扮演着重要的角色外,同时也在调节成体组织细胞的命运决定、增殖分化和再生中不可或缺。本实验以长牡蛎(Crassostrea gigas)为研究对象,探究Wnt信号通路对免疫应答过程中血淋巴细胞增殖的调控作用,取得的主要研究结果如下:1.发现长牡蛎Cg Wnt-1主要分布在血淋巴细胞细胞膜上利用长牡蛎转录组数据分析了Cg Wnt-1在胚胎发育不同阶段的表达水平,发现Cg Wnt-1 m RNA在稚贝期表达量最高,为担轮幼虫期表达量的26.91倍。在成体不同组织中均能检测到Cg Wnt-1 m RNA的表达,Cg Wnt-1蛋白主要分布在血淋AY-22989体外巴细胞的细胞膜上。2.筛选获得了Cg Wnt-1的潜在受体Cg Frizzled-5。利用生物膜干涉技术发现r Cg Wnt-1与r Cg Frizzled-5、r Cg Frizzled-7、r Cg Frizzled-9和r Cg Frizzled-10之间存在相互作用,结合常数分别为K_D=4.32×10~(-8) M、K_D=1.61×10~(-4) M、K_D=1.25×10~(-7) M和K_D=1.81×10~(-7) M,其中r Cg Wnt-1与r Cg Frizzled-5结合能力最强。进一步分析Cg Frizzled-5的表达及分布特征发现,Cg Frizzled-5 m RNA在胚胎发育的桑葚期表达量最高,为幼贝期表达量的6.86倍,在成体不同组织中均能检测到表达。Cg Frizzled-5蛋白主要分布在血淋巴细胞的细胞膜上。3.发现免疫刺激能显著诱导Cg Wnt-1信号的激活灿烂弧菌V.splendidus刺激后,长牡蛎血淋巴细胞中Cg Wnt-1的m RNA表达量在3 h,12 h,24 h和48 h显著升高,分别为对照组的3.31倍(p<0.05)、6.35倍(p<0.05)、8.23倍(p<0.05)和13.09倍(p<0.05)。Cg Frizzled-5的m RNA表达在V.splendidus刺激后的6 h,12 h,24 h和48 h显著升高,分别为对照组的8.85倍(p<0.05)、9.13倍(p<0.05)、3.28倍(p<0.05)和1.54倍(p<0.05)。Wnt信号关键分子Cgβ-catenin的表达水平在V.splendidus刺激后3,12,24,48 h显著升高,分别为对照组的3.00(p<0.05),3.00(p<0.05),2.98(p<0.05),3.14(p<0.05)倍。体内注射重组蛋白r Cg Wnt-1后,长牡蛎血淋巴细胞中Cgβ-catenin的表达量显著升高,为r TRX组的4.86倍(p<0.05)。Wnt信号小分子抑制剂C59与r Cg W nt-1同时注射后,Cgβ-catenin的m RNA表达水平显著降低,为r Cg Wnt-1组的0.32倍(p<0.05)。采用RNAi技术抑制Cg Wnt-1的表达,灿烂弧菌二次刺激6 h,血淋巴细胞中Cgβ-catenin的m RNA表达量显著降低,为对照组的0.58倍(p<0.05);Cg GSK-3β的m RNA表达量显著升高,是对照组的1.96倍(p<0.05)。二次刺激12 h,VV-Cg Wnt-1-RNAi实验组与VV-EGFP-RNAi对照组相比,Cgβ-catenin和Cg GSK-3β的m RNA表达量显著降低,分别为对照组的0.27倍(p<0.05)和0.25倍(p<0.05)。4.发现Cg Wnt-1可以促进长牡蛎血淋巴细胞的增殖体内注射重组蛋白r Cg Wnt-1后,结果显示长牡蛎血淋巴细胞中造血相关因子(Cg Runx-1和Cg GATA-3)细胞周期相关蛋白(Cg CDC-45和Cg CDK-2)的m RNA表达量显著升高,分别为r TRX组的9.33倍(p<0.05)、4.65倍(p<0.05)、3.32倍(p<0.05)和6.09倍(p<0.05)。Wnt信号抑制剂C59与r Cg Wnt-1同时注射后,Cg Runx-1、Cg GATA-3、Cg CDK-2、Cg CDC-45的m RNA表达显著降低,分别是r Cg Wnt-1组的0.16倍(p<0.05),0.56倍(p<0.05),0.25倍(p<0.05)和0.44倍(p<0.05)。r Cg Wnt-1处理后12 h,血淋巴细胞中Ed U~+细胞的比例显著增加,为对照组(r TRX)的2.88倍(p<0.05)。当Wnt信号抑制剂C59与r Cg Wnt-1同时注射时,血淋巴细胞中Ed U~+细胞的比例显著减少,为对照组(r Cg Wnt-1)的0.15倍(p<0.05)。用RNAi技术抑制Cg Wnt-1的表达,灿烂弧菌二次刺激6 h,Cg Wnt-1-RNAi实验组血淋巴细胞中造血相关转录因子(Cg Runx-1、Cg BMP-7和Cg GATA-3)和细胞周期相关蛋白(Cg CDC-45和Cg CDK-2)的m RNA表达水平显著降低,分别是VV-EGFP-RNAi对照组的0.36倍(p<0.05)、0.43倍(p<0.05)、0.52倍(p<0.05)、0.40倍(p<0.01)和0.48倍(p<0.05)。二次刺激12 h后,血淋巴细胞中Cg Runx-1、Cg GATA-3、Cg BMP-7的m RNA表达均显著降低,分别是对照组的0.08倍(p<0.05)、0.53倍(p<0.05)、0.46倍(p<0.05),Cg CDK-2的m RNA表达显著升高,是对照组的1.74倍(p<0.05)。在灿烂弧菌二次刺激6 h和12 h,Wnt-1-RNAi组血淋巴细胞中Ed U~+细胞的比例显著降低,分别为对照组的0.49倍(p<0.05)和0.40倍(p<0.05)。综上所述,本研究从长牡蛎中鉴定出Cg Wnt-1及其潜在受体Cgfrizzled-5基因,发现它们能显著响应V.splendidus免疫刺激。Cg Wnt-1可通过与受体Cgfrizzled-5结合激活经典的Wnt/β-catenin信号通路,调节造血转录因子和细胞周期蛋白的表达,促进血淋巴细胞的增殖。研究结果为深入理解海洋无脊椎动物Wnt信号通VX-445溶解度路组成及其对免疫细胞增殖的调节机制提供了重要参考。