EBV是已知的八大疱疹病毒之一,与源自B细胞的淋巴瘤以及鼻咽癌、胃癌等上皮癌症密切相关。近年来,许多学者指出EBV可能在其他多种上皮癌症中发挥作用。由于结直肠上皮与胃上皮具有组织相似性,越来越多学者开始关注结直肠癌与EBV的相关性并从中发现了基因组存在的证据。EBV在鼻咽癌和胃癌中已被广泛报道参与细胞增殖、凋亡、分化、迁移、侵袭等功能促进肿瘤的发生发展以及免疫微环境的调控。本研究在此基础上进一步探究EBV与结直肠癌的相关性。目的1.检测常见致癌病毒在结直肠癌中的感染率,寻找与结直肠癌发生相关性最高的病毒;2.通过免疫组化染色结果分析EBV相关结直肠癌(EBVaCRC)的免疫微环境组成,通过临床信息的统计学分析研究EBVaCRC患者的临床及病理学特征;3.通过构建EBV感染结肠癌细胞HCT116研究EBV对HCT116增殖及凋亡功能的影响。材料和方法1.收集2017年1月至2019年1月期间的结直肠癌肿瘤蜡块样本82例,提取蜡块组织DNA,通过PCR和巢式PCR检测EBV、HPV、CMV、JCV在结直肠癌中的感染率。通过原位杂交检测EBER信号进一步明确EBV感染以及在组织中的定位;2.通过对石蜡切片进行免疫组化从而分析免疫标志物PD-1、PD-L1、CD8、CD3、CD20、CD56、CD68、CD163在EBVaCRC与EBV阴性结直肠癌(EBVnCRC)中的表达差异。收集临床数据并通过统计学方法分析EBVaCRC患者的临床病理学特征及预后;3.体外制备高滴度EBV并感染人结肠癌细胞HCT116进一步构建EBV稳定感染的HCT116细胞(HCT116-EBV);通过CCK8和细胞周期实验验证EBV对HCT116增殖和细胞周期进程的影响,通过流式细胞术以及WB验证EBV对Ras抑制剂HCT116凋亡的影响。结果1.在82例结直肠癌蜡块组织中,EBV在本研究检测的肿瘤相关病毒中感染率最高(15/82,18.3%),而HPV、CMV、JCV未被检出。原位杂交结果显示12例存在EBER信号,定位于上皮和/或淋巴细胞;2.免疫组化结果表明EBVaCRC免疫微环境中CD3~+T细胞,Cselleck 3-MAD8~+T细胞,CD20~+B细胞,CD68~+巨噬细胞,CD56~+NK细胞的浸润密度显著高于对照组EBVnCRC,而CD163~+M2-巨噬细胞浸润密度在两组间无显著差异。半定量免疫组化结果表明EBVaCRC的肿瘤细胞及肿瘤浸润免疫细胞上的PD-1和PD-L1表达水平显著高于EBVnCRC。相较于EBVnCRC患者来说,EBV阳性与结直肠癌患者预后无显著相关性,但EBVaCRC患者表现为更早期的临床分期;此外两组间性别、年龄、肿瘤大小和转移、肿瘤类型均无统计学差异;3.CCK8法检测HCT116-EBV增值能力显著高于HCT116-control。细胞周期实验表明HCT116-EBimmune systemV G1期细胞比例降低,S期和G2期细胞比例增加。流式细胞术检测HCT116-EBV凋亡细胞比例显著降低,抗凋亡蛋白Bcl-2相对表达升高,促凋亡蛋白Bax和Caspase-3相对表达降低。结论1.EBV在本研究检测的结直肠癌常见致癌病毒中检出率最高,在结直肠癌中定位于上皮和/或淋巴细胞,大多数为潜伏感染模式;2.EBVaCRC具有以免疫细胞浸润增加及免疫检查点上调构成的炎性免疫微环境,是免疫检查点治疗的候选者;EBV阳性与结直肠癌患者更早分期相关,与预后无关;3.体外实验证明EBV促进结直肠癌细胞增殖、加快细胞周期进程,同时抑制细胞凋亡。