H9N2亚型Dorsomorphin说明书禽流感是由甲型禽流感病毒的亚型H9N2毒株引起的一种急性、高度接触性传染病。禽类感染该病时,引起呼吸道症状,侵害生殖系统,蛋禽产蛋下降,病愈后难以恢复正常水平。该病毒会引起严重的免疫抑制,继发其他病原感染,导致感染禽类大量死亡。近年来,H9N2亚型禽流感在亚洲、欧洲、北美等地区大面积流行,给养殖业带来了严重危害。目前,发现疫情主要依靠日常监测,利用紧急免疫、隔离治疗来控制该病的传播。因此,建立便捷灵敏、特异性好的检测方法对H9N2亚型禽流感的监测控制具有重大意义。为了建立普遍适用的检测方法,本研究从山东新泰某鸡场分离了一株H9N2亚型禽流感病毒,分别对HA基因和M基因进行遗传进化分析,结果显示:分离株QS株的HA基因与各分支参考株的核苷酸同源性为78.3%～93.5%,属于h9.4.2.5分支,但与常见疫苗株不在同一分支,selleck亲缘关系较远,表明分离株HA基因已发生明显遗传变异;分离株M基因与各分支参考株的核苷酸同源性为82.7%～99.8%,序列较为保守,与疫苗株WJ57处于同一分支,亲缘关系较近。因此选取H9N2亚型禽流感病毒保守基因M基因建立检测方法。CRISPR/Cas系统为临场快速检测病原体提供了新的思路。CRISPR-Cas13a系统在切割靶标RNA后能够激活附带切割活性,可以非特异性切割附近的ss RNA。根据这种特性,加入RNA报告基团就可以实现病原体的可视化检测。临床应用中,利用重组酶聚合酶等温扩增(RPA)先将DNA预扩增,再由T7体外转录靶标为RNA,CRISPR-Cas13a-cr RNA复合体能够激活、裂解RNA报告基团,这样就能更快、更灵敏地检测到临床样品中的靶标RNA。本研究针对H9N2亚型禽流感病毒,将RPA与CRISPR-Cas13a系统相结合,成功建立了两种检测方法,可以通过监测荧光信号、蓝光照射以及试纸条判读检测结果。一种是基于RPA-CRISPR-Cas13a建立了荧光检测方法并优化了反应体系:利用H9N2亚型AIV分离株(QS株)的M基因以及RPA引物设计原则,设计了4对RPA引物,分别进行等温扩增和电泳验证,成功筛选出一对扩增效率最高的RPA引物;设计了3条cr RNA,经测试筛选出最佳cr RNA为cr RNA1;对检测体系进行了反应优化,在优化体系中,cr RNA最佳反应浓度为2.56 ng/μL,Cas13a蛋白最佳反应浓度为3.937ng/μL。同时,将一步法检测和两步法检测进行了比对,结果显示一步法检测反应更迅速且敏感性更高;荧光检测和蓝光照射的灵敏性结果显示:检测质粒下限为10copies/μL;荧光检测和蓝光照射的特异性结果显示:当检测其他禽类常见传染病病原时并无交叉反应,表明特异性良好;将建立的检测方法应用于临床,一共检测了48份疑似感染H9N2亚型禽流感的临床样品,检测结果与PCR检测结果一致,阳性阴性符合率为100%。另一种是基于RPA-CRISPR-Cas13a的建立了试纸条检测方法:试纸条灵敏性结果显示出试纸条的检测下限为10~2copies/μL;特异性检测结果显示,检测其他禽类传染病病原时,仅针对H9N2亚型禽流感病毒出现测试带,表明特异性良好;使用该方法检测48份临床样品,阳性符合率约为94%。综上所述,利用CRISPR-Cas13a检测技术检测H9N2亚型AIV时,不仅快捷灵敏、特异性高,而且在使用蓝光照射和试纸条检测时无需特殊仪器,肉眼可以直接判读结果,适用于H9N2亚型禽流感病毒的现场初筛。该检测方法的建milk microbiome立和应用为H9N2亚型禽流感病毒的快捷诊断提供了新的思路,对H9N2亚型禽流感的防控具有重要意义。