目的:验证四神丸调节记忆性Treg/Th17细胞平衡治疗葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的慢性复发性溃疡性结肠炎(UC)的同时,观察四神丸对Numb/Notch-糖代谢途径中各类蛋白及基因的影响,从干预Numb/Notch-糖代谢途径探究四神丸调节记忆性Treg/Th17细胞平衡治疗UC的可能作用机制。方法:1.动物模型的复制与给药方法:将40只6-8周龄的SPF级BALB/c雄性小鼠随机分为4组,即正常组(Control)、正常+四神丸组(Ctrl+SSP)、模型组(DSS)、模型+四神丸组(DSS+SSP),每组10只。其中,正常组与正常加四神丸组全程自由饮用蒸馏水,模型组与模型加四神丸组给予3%(w/v)DSS溶液连续自由饮用7天后,停用DSS溶液并换成蒸馏水自由饮用7天后,再换成2.5%(w/v)DSS溶液自由饮用7天,最后停用DSS溶液1天后处死小鼠,即慢性复发性溃疡性结肠炎模型复制完成。以小鼠第一天饮用3%(w/v)DSS溶液为第1d,第7天停用3%(w/v)DSS溶液并开始按照小鼠体重给予四神丸灌胃给药治疗,正常组、正常加四renal autoimmune diseases神丸组以及模型组均灌用蒸馏水,根据预实验结果,模型加四神丸组给予5g/kg四神丸混悬液,每日1次,固定时间进行灌胃治疗,连续给药两周后,麻醉处死老鼠,并立即分离脾脏、结肠以及肠系膜淋巴结。2.四神丸治疗DSS诱导的慢性复发性UC小鼠的疗效评价:每日记录小鼠的体重变化,计算小鼠的体重变化率[体重变化率=小鼠每日体重(g)/小鼠初始体重(g)×100%],同时在实验期间对每一只小鼠粪便状态的变化(包括黏稠度)、粪便隐血进行评估,并观察小鼠每天的精神状态、饮食情况等,并用疾病活动指数(Disease active index,DAI)[DAI=体重变化评分+粪便黏稠度评分+便血评分]评估小鼠的具体情况,给药2周后将小鼠麻醉处死,分离脾脏、结肠以及肠系膜淋巴结。测量结肠长度,称量脾脏、结肠重量,,并计算其肠重指数、脾重指数、结肠重量指数以及单位长度下结肠重量。制作结肠组织石蜡切片,通过双盲法进行显微镜观察,评估结肠病理组织形态的变化。3.四神丸对记忆性Treg/Th17细胞平衡的调控作用:采用流式细胞术(FCM)检测小鼠肠系膜淋巴结细胞T细胞亚群中记忆性Treg细胞和记忆性Th17细胞的表达水平,具体为效应记忆性Treg细胞(CD4~+CCR7~-Foxp3~+,TEM-m Treg)、中枢记忆性Treg细胞(CD4~+CCR7~+Foxp3~+,TCM-m Treg)、效应记忆性Th17细胞(CD4~+CCR7~-IL-17~+,TEM-m Th17)、中枢记忆性Th17细胞(CD4~+CCR7~+IL-17~+,TCM-m Th17),验证四神丸调控Treg/Th17细胞平衡的作用。4.糖代谢与能量代谢途径相关指标检测:通过酶联免疫吸附测定(ELISA)对小鼠结肠己糖激酶2(HK2)、丙酮酸激酶(PK)、葡萄糖6-磷酸酶(G6pase)、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK)、醛缩酶A(ALDA)、葡萄糖激酶(GCK)、乳酸脱氢酶A(LDH-A)、三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)、一磷酸腺苷(AMP)、腺苷(Ado)进行检测,探究四神丸对能量代谢与糖代谢的影响。5.Numb/Notch-糖代谢途径相关蛋白检测:采用蛋白免疫印迹(WB)方法,对Numb/Notch-糖代谢途径相关蛋白如Numb、Notch3、DLL1、DLL2、DLL4、MSI2、Maml1、Jagged1、GLlut1、Glut4、Gsk3β、STAT4、smad2/3,探究四神丸对Numb/Notch-糖代谢途径的调控作用。6.数据分析:使用SPSS22.0软件进行统计学分析,组间比较采用对照t检验和单因素方差分析,以Mean±SEM表示,P<0.05代表数据统计结果具有显著差异,P<0.01代表数据统计结果具有极显著差异,然后用Graph Pad Prism 8.0软件制作统计图。结果:1.四神丸对DSS诱导的慢Adavosertib细胞培养性复发性UC小鼠的疗效评价经四神丸治疗后,与模型组相比,模型+四神丸组小鼠的一般状态有明显的好转,饮食量和体重显著增加,精神状态明显改善,大便性状、每日OB评分以及DAI评分等明显降低(P<0.05或P<0.01),结肠长度明显恢复(P<0.05),镜下结肠组织病理损伤明显恢复(P<0.05),结肠重量、结肠单位长度重量、结肠重量指数、脾脏重量、脾脏重量指数均有明显下降(P<0.05或P<0.01)。说明四神丸可以恢复溃疡性结肠炎小鼠的疾病状态。2.四神丸对慢性复发性UC小鼠记忆性Treg/Th17细胞的平衡作用与正常组相比,模型组中IDN-6556生产商枢记忆性与效应记忆性Treg细胞数量下降(P<0.05或P<0.01),中枢记忆性与效应记忆性Th17细胞数量上升;经给药治疗后,模型+四神丸组记忆性Treg细胞数量上升(P<0.05或P<0.01)、Th17细胞数量明显下降(P<0.05或P<0.01),记忆性Treg/Th17比值升高(P<0.05或P<0.01),而IL-10的水平也明显升高(P<0.05)。此结果表示四神丸能够调节记忆性Treg/Th17细胞的平衡。3.四神丸对慢性复发性UC小鼠Numb/Notch通路与糖代谢途径的调节作用与正常组相比,模型组Notch3、DLL1、DLL2、DLL4表达量均显著升高(P<0.05或P<0.01),而Numb表达量显著下降(P<0.05或P<0.01),与模型组相比,经给药治疗后,模型加四神丸组Notch3、DLL1、DLL2、DLL4表达量均显著下降(P<0.05或P<0.01),而Numb表达量显著升高(P<0.05或P<0.01)。采用酶联免疫吸附法对ATP、ADP、AMP、Ado、HK2、PK、G6pase、PEPCK、ALDA、GCK、LDH-A进行检测,与正常组相比,模型组Ado表达量下降(P<0.05),其余指标表达量均显著升高(P<0.05或P<0.01),经四神丸治疗后,ATP、ADP、AMP、Ado、HK2、PK、G6pase、PEPCK、ALDA、GCK、LDH-A表达量均显著下降(P<0.05或P<0.01),且Ado表达量升高(P<0.05)。此结果提示四神丸可能通过抑制Numb/Notch信号的活化以及纠正糖代谢水平。结论:1.四神丸可以有效治疗DSS诱导的慢性复发性溃疡性结肠炎。2.四神丸治疗DSS诱导的慢性复发性溃疡性结肠炎作用机制可能通过干预Numb/Notch-糖代谢途径调控记忆性Treg/Th17细胞的平衡来实现的。