猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的一种急性、高传染性肠道传染病,近年来给全球养殖业带来了巨大的经济损失。目前已知的几乎所有病毒都完全依赖宿主细胞的蛋白质合成机制来制造病毒进行生命活动所需的蛋白质。因此,病毒通常能够影响细胞的蛋白翻译系统,避开限制病毒传播的细胞防线,抑制细胞的凋亡、炎症和免疫等抗病毒反应,确保其m RNA能够正常翻译。PEDV Nsp14蛋白是一种具有双重酶功能的蛋白,其C端具有核酸外切酶活性,N端具有甲基转移酶活性,是复制-转录复合体的一部分,在病毒复制过程中发挥重要作用。我们首先通过Western Blot实验验证了PEDV Nsp14蛋白能够抑制蛋白合成,但是其抑制蛋白合成的具体机制尚不清楚。因为GFP蛋白的合成主要是通过帽依赖的方式进行翻译合成的,所以接下来我们将PRK5-Myc-Nsp14重组质粒与p EGFP-N1质粒共转染细胞,检测了GFP蛋白的表达,以此来确定PEDV Nsp14蛋白是否可能通过作用于帽依赖的蛋白翻译抑制宿主细胞蛋白合成。结果显示,PEDV Nsp14蛋白同样能够抑制GFP蛋白的表达,且这种抑制效果呈剂量梯度依赖性。在蛋白合成的起始阶段,蛋白翻译起始复合物4F(eukaryotic initiaDibutyryl-cAMP试剂tion factors4F,EIF4F)发挥着极其重要的作用,其由e IF4G、e IF4E、e IF4A组成,在翻译过程中发挥重要作用,所以接下来我们探究了PEDV Nsp14蛋白对翻译相关蛋白的影响,Western Blot结果显示,PEDV Nsp14蛋白对e IF4G和e IF4E蛋白的表达都具有抑制作用。为了探究PEDV Nsp14蛋白是如何降低e IF4G和e IF4E的表达水平的,我们先从蛋白降解途径入手,用蛋白酶体抑制剂和溶酶体抑制剂分别处理已经转染PRK5-Myc-Nsp14重组质粒24 h后的细胞,Western Blot技术检测发现,e IF4E蛋白的表达水平基本恢复,但是e IF4G蛋白的表达水平只恢复了部分,与之对应的是,细胞中总蛋白的合成也并未完全恢复。这说明PEDV Nsp14蛋白可能还存在其他途径抑制宿主细胞的蛋白表达。由于细胞抵御病毒入侵的措施之一就是内质网应激,减少细胞的蛋白合成,所以我们猜测PEDV Nsp14蛋白能通过这一途径影响细胞的蛋白合成,于是我们利用寻找更多Western Blot技术检测marine biofouling发现PEDV Nsp14蛋白能够上调P-e IF2α蛋白的表达水平,而P-e IF2α蛋白表达水平的上调又间接导致翻译受到抑制。接下来我们继续探索PEDV Nsp14蛋白甲基转移酶活性缺失的突变体在抑制蛋白合成过程中发挥的作用,由于之前的实验已经获得了PEDV Nsp14蛋白甲基转移酶活性缺失的突变重组质粒,所以我们将其转染细胞后,发现PEDV Nsp14蛋白突变体不具有抑制宿主细胞翻译的功能,也不再能够上调P-e IF2α蛋白的表达水平。综上所述,在本研究中,我们发现PEDV Nsp14蛋白能够通过溶酶体途径抑制蛋白翻译起始复合物中e IF4G和e IF4E蛋白的表达从而抑制宿主细胞的蛋白合成,PEDV Nsp14蛋白的甲基转移酶活性在病毒的复制和逃避宿主的抗病毒反应过程中发挥着重要作用。本研究初步阐明了PEDV Nsp14蛋白抑制宿主细胞蛋白合成的分子机制,为研发针对PEDV的药物及疫苗提供了新的思路和潜在靶点。