脑出血(Intracerebral Hemorrhage,ICH)是常见的脑卒中类型,具有致死率高,致残率高等特点。目前,ICH主要的治疗手段是手术解除血肿压迫,但其疗效仍缺乏令人信服的结论。原因是因为继发性脑损伤的存在,但目前继发损伤具体机制尚不清楚。因此探索ICH后潜在的继发性损伤机制,对治疗ICH至关重要。细胞外囊泡(Extracellular Vesicles,EVs)是细胞间通讯所必需的介质。研究表明,Colforsin核磁EVs参与了疾病调控诸多调控过程,例如,炎症,氧化应激,肿瘤生长等。已经证明所有中枢神经系统细胞都能释放EVs即脑源性EVs,并参与许多生理和病理过程。然而,脑源性的EVs是否在ICH发生发展过程中发挥作用,目前还不明确。研究发现,血浆中存在人体的脑源性EVs,这结果提示脑源性EVs可能是脑组织调控外周器官的另一种手段。在脑外伤研究中,已经证实脑损伤后脑源性EVs能够进入血液,是造成脑外伤全身凝血反应的重要诱因,但在ICH中,脑源性EVs是否调节外周器官损伤作用目前还没人报道。卒中相关肺炎(Stroke-associated Pneumonia,SAP)是中风后常见并发症,且与患者预后密切相关。临床上已经发现,相比于缺血性卒中,ICH患者更易并发的全身炎症反应和卒中性肺炎。然而,目前对于ICH对卒中后肺炎调控机制仍然Blebbistatin说明书不清楚。为明确ICH后脑源性EVs对脑和肺损伤的作用效果及其机制,我们提取了 ICH后脑组织的EVs,并分析了 ICH后不同脑细胞分泌的EVs的变化特点。同时,我们也探讨了三种EVs亚型:微囊泡(Microvesicles,MV),外泌体(Exosomes,EXO)和线粒体囊泡(Mitovesicles,MIT),分别对ICH影响。发现在ICH中,MIT可以通过携带的线粒体DNA(Mitochondrial DNA,mtDNA)诱发cGAS-STING通路激活,促进ICH炎性损伤作用。同时我们进一步探究MIT对外周和肺部炎症的影响。本研究共分为以下六部分:1.ICH后脑组织分泌EVs的特点。2.ICH后分泌不同亚型的EVs对ICH脑组织损伤的影响。3.ICH后分泌MIT对ICH脑组织损伤的作用及机制4.ICH后分泌MIT促进脑组织炎症反应作用机制。5.血浆EVs中的mtDNA与外周炎症相关关系。6.ICH后分泌MIT对ICH后肺部炎症影响。第一部分ICH后脑组织分泌的EVs的特点方法建立小鼠ICH模后,高速离心提取脑源性EVs。电镜和纳米粒径分析鉴定脑源性EVs。免疫印迹(Western Blot,WB)检测脑源性EVs上星型胶质细胞,少突胶质细胞,神经元细胞和小胶质细胞标志蛋白(Marker)表达。纳米流式实验检测脑源性EVs上CD11b,CD56和EAAT1的表达。利用不同浓度的OptiPrep缓冲液,将脑源性EVs分离为微MV,EXO和MIT。粒径分析分别检测Sham组和ICH组的MV,EXO和MIT。WB分别检测Sham组和ICH组的MV,EXO和MITMarker蛋白。考马斯亮蓝代表不同样本总蛋白表达。结果1.通过建模ICH和不同速度离心提取EVs后,电镜下可见膜性EVs且粒径分析EVs直径在200 nm以下。这些结果提示我们成功提取脑源性EVs。2.粒径分析结果显示相比于Sham组,ICH在1天(d)出现EVs升高,而在2,3和7 d未见明显变化。说明脑源性EVs在ICH早期升高。3.WB检测星型胶质细胞Marker蛋白(EAAT1,EAAT2)升高,而少突胶质细胞Marker蛋白(CNP,PLP)、神经元细胞Marker蛋白(SYNl,SNAP-25)和小胶质细胞Marker蛋白(P2Y12,TMEM119)未见明显变化。纳米流式结果发现星形胶质细胞分泌的EVs早期明显升高,而小胶质细胞和神经元分泌的EVs变化不明显。4.相比于Sham组,WB结果显示在ICH组中MVMarker蛋白(Annexinl,Annexin)、EXOMarker 蛋白(Alix,TSG101)和 MITMarker 蛋白(PDH-lEα,VDAC)均升高。结论脑源性EVs在ICH早期升高,且星形胶质细胞分泌的EVs是主要贡献者。ICH后,脑组织MV,EXO和MIT分泌均增加。第二部分ICH后脑组织分泌的MIT加重脑组织的损伤方法尾静脉注射生理盐水(Vector),ICH脑组织提取的MV(ICH-MV)、EXO(ICH-EXO)和MIT(ICH-MIT)后,核磁(MRI)扫描颅内血体积,TUNEL染色检测脑组织凋亡和行为学实验(粘附实验,圆筒实验,爬行网格实验)检测小鼠运动功能。尾静脉注射生理盐水(Vector),Sham组提取的MIT(Sham-MIT)和ICH组提取的MIT(ICH-MIT)后,MRI扫描颅内血体积,TUNEL染色检测脑组织凋亡和行为学实验(粘附实验,圆筒实验,爬行网格实验)检测小鼠运动功能。纳米流式检测脑源性EVs的COXIV表达。结果1.MRI扫描发现,相比于注射Vector,ICH-MV和ICH-EXO组,注射ICH-MIT的ICH小鼠颅内血肿体积增大。2.TUNEL结果显示,相比于注射Vector,注射ICH-MIT小鼠TUNEL阳性细胞明显增加,而注射ICH-MV和ICH-EXO的ICH小鼠TUNEL未见明显变化。说明MIT促进ICH脑组织的凋亡。3.相比于注射Vector组,注射ICH-MISaxitoxin biosynthesis genesT小鼠在粘附实验中,摆脱纸片时间延长;在圆筒实验中,健侧前爪使用频率增加;在爬行网格实验中,前爪患侧出错率增加。注射ICH-MV和ICH-EXO的ICH小鼠行为实验未见明显改变。4.MRI扫描发现,相比于注射Vector,注射ICH-MIT小鼠颅内血肿体积增大,而注射Sham-ICH未见明显变化。5.TUNEL结果显示,相比于注射Vector,注射ICH-MIT小鼠TUNEL阳性细胞明显增加,而注射Sham-ICH未见明显变化TUNEL未见明显变化。说明ICH-MIT促进ICH脑组织的凋亡。6.注射ICH-MIT小鼠,相比于注射Sham-ICH,在粘附实验中,摆脱纸片时间延长;在圆筒实验中,健侧前爪使用频率增加;在爬行网格实验中,前爪患侧出错率增加。结论ICH后分泌MIT加重ICH后脑组织的损伤。第三部分ICH后脑组织分泌的MIT诱发脑组织炎症反应方法向ICH小鼠尾静脉中注射Sham-MIT和ICH-MIT后,对出血的脑组织进行RNA-seq测序。尾静脉注射Dir和PKH-67染色Sham-MIT和ICH-MIT后,分别对小鼠进行体外成像和其脑组织免疫荧光染色。尾静脉注射Sham-MIT和ICH-MIT后,对脑出血组织进行流式检测。PCR检测组织的TNF-α,IL-1β,IFNγ和IL-6。结果1.尾静脉注射Sham-MIT和ICH-MIT,RNA-seq测序升高的基因的GO富集分析发现炎症通路升高。KEGG富集通路分析发现TNF、IL-17、Toll-like和NF-κB炎症通路被激活。说明相比于注射Sham-MIT,注射ICH-MIT小鼠促进ICH脑组织炎症通路激活。2.ICH小鼠尾静脉注射Dir染色的Sham-MIT和ICH-MIT,体外成像发现颅内荧光标记增强,说明染色的MIT进入脑组织内。3.免疫荧光染色发现PKH-67染色的MIT,能与小胶质细胞Marker(Iba1)共标,说明注射的MIT在脑组织中进入小胶细胞。4.细胞流式结果显示,尾静脉注射ICH-MIT 比Sham-MIT组CD11b+/CD45int的细胞数量增加,且CD86细胞比例增加。说明ICH后分泌的MIT促进小胶质细胞激活,并促进小胶质细胞/巨噬细胞向M1型极化。5.相比于尾静脉注射Sham-ICH,PCR结果显示注射ICH-MIT的小鼠脑组织TNF-α,IL-1β,IFNγ和IL-6表达明显升高。说明ICH后分泌的MIT促进脑组织炎症因子升高。结论ICH后提取MIT促进ICH脑组织的炎症反应。第四部分ICH后脑组织分泌的MIT通过cGAS-STING通路促进脑组织炎症反应方法PCR检测MV,EXO和MIT中RNR1的表达量。PCR检测 Sham-MIT和ICH-MIT中的D-LOOP,RNR1,ND1,ND4和CytB的表达。向小胶质细胞中加入Sham-MIT 和 ICH-MIT,WB检测 Cgas,STING,BK1,p-TBK1,NF-κB,p-NF-κB,β-Actin 的表达。向STINGfl/fl小鼠原代小胶质细胞中加入Vector和Cre酶后,WB检测cGAS,STING,TBK1,p-TBK1,NF-κB,p-NF-κB和β-Actin的表达。向原代小胶质细胞中加入用 DNase I 酶处理的 ICH-MIT,WB 检测 cGAS,STING,TBK1,p-TBK1,NF-κB,p-NF-κB和β-Actin的表达。向STINGfl/fl小鼠尾静脉注射Vector,STINGCKO小鼠注射Vector和STINGCKO小鼠注射ICH-MIT后,对小鼠进行MRI检测。结果1.相比于MV和EXO,PCR结果显示在MIT中mtDNA的Marker基因RNR1明显升高。说明MIT中富含mtDNA。2.相比于 Sham-MIT,PCR 检测ICH-MIT 中 mtDNA 的 Marker 基因 D-LOOP,RNR1,ND1,ND4和CytB,其表达均明显升高。说明ICH脑组织分泌的MIT中mtDNA增多。3.加入Sham-MIT和ICH-MIT,WB发现加入ICH-MIT后小胶质细胞中cGAS,STING,p-TBK1,p-NF-κB蛋白表明显升高。说明ICH脑组织分泌的MIT促进小胶质细胞cGAS-STING-NF-κB通路激活。4.加入DNase Ⅰ酶(DNA去除剂)处理后的ICH-MIT,WB结果显示小胶质细胞中cGAS-STING,p-TBK和p-NF-κB蛋白表降低。说明ICH后脑组织分泌的MIT通过携带的mtDNA促进小胶质细胞cGAS-STING-NF-κB通路激活。5.加入Cre酶基因敲除STING的原代小胶质细胞,WB检测结果显示下游蛋白p-TBK,p-NF-κB蛋白表降低。进一步说明ICH脑组织分泌的MIT促进小胶质细胞cGAS-STING-NF-κB 通路激活。6.MRI结果显示相比STINGfl/fl小鼠,STINGCKO小鼠血肿体积明显减少。同时,相比于注射Vector组注射ICH-MIT后,敲除STINGCKO小鼠血肿体积未见明显变化。说明MIT促进脑组织损伤通过cGAS-STING-NF-κB通路。结论脑出血后通过MIT中的mtDNA激活cGAS-STING通路加重脑组织炎症损伤。第五部分外周血中细胞外囊泡中mtDNA与ICH外周炎症相关方法临床收集88例ICH病人和15例健康人群血浆,收集临床信息。提取血浆中的EVs,纳米流式实验检测健康人群和病人血浆中的EVs。通过抗体生物素沉淀法,提取血浆中含有神经元Marker L1CAM和星型胶质细胞Marker EAAT1的EVs。电镜,粒径分析提取的EVs。免疫印迹检测提取EVs的对应的蛋白神经元Marker NSE,星型细胞Marker GFAP。WB检测提取EVs的VDAC。提取血浆中的EVs的mtDNA,PCR检测RNR1的表达量。提取血浆EVs中的mtDNA,计算mtDNA拷贝数。对病人入院后GCS评分,我们将病人分为严重组(GCS≤8,Bad outcome)和轻型组(GCS>8,Good outcome)。分别进行多因素logistic分析。采用ROC曲线分析检测血浆EVs中mtDNA水平与脑出血病人的病情关系。Pearson相关分析mtDNA拷贝数与ICH病人血肿体积、C 反应蛋白(C Reactive Protein,CRP)关系。结果1,纳米流式结果中发现ICH后病人血浆中EAAT和CD56阳性的EVs比例明显增加。说明相比于健康人,ICH病人血浆中星型胶质细胞和神经元来源的EVs增多。2.生物素沉淀法检测结果显示ICH后病人血浆中神经元和星形胶质细胞源的EVs增加。3.WB检测ICH后血浆中神经元和星形胶质细胞源的MIT中蛋白VDAC增加。PCR结果显示出血后神经元和星形胶质细胞源的EVs携带的mtDNA增加。4.多因素logistic分析,我们发现病人的年龄,血肿的大小,血浆CRP水平和血浆EVs中mtDNA拷贝数与ICH病人的病情轻重相关。5.ROC曲线分析结果说明血浆EVs中mtDNA水平对脑出血病人的病情轻重的具有判别能力。6.血浆中EVs中mtDNA水平越高,病人3个月后的mRS评分越高。说明血浆中EVs的mtDNA水平高的病人预后越差。7.Pearson相关分析结果显示mtDNA的表达量与病人血肿体积和CRP呈正相关。结论ICH后血浆中脑源性EVs增多;血浆中EVs的mtDNA水平可以作为预测ICH病情的生物标志物且与病人血肿体积和外周炎症相关。第六部分ICH后脑组织分泌的MIT加重ICH肺部炎症产生方法尾静脉注射预先Dir染色的Sham-MIT和ICH-MIT,取小鼠的脑,心脏,肺脏,肝脏,脾脏和肾脏进行体外成像实验。尾静脉注射Sham-MIT和ICH-MIT,对血浆和肺组织匀浆进行菌落计数实验。尾静脉注射Sham-MIT和ICH-MIT,对肺脏,肝脏和肺脏组织的IL-1β,IL-6和MCP-1进行PCR检测。尾静脉注射Sham-MIT和ICH-MIT,对小鼠的肺组织进行HE染色。结果1.PCR检测结果显示尾静脉注射ICH-MIT的小鼠的肺脏,肝脏和肾脏组织的IL-1β,IL-6 和 MCP-1 水平比 Sham-MIT 升高。2.菌落形成实验结果显示,相比于尾静脉注射Sham-ICH,注射ICH-MIT的小鼠血浆和肺组织,形成菌落数更多。3.HE实验结果显示相比于注射Sham-MIT的小鼠,注射ICH-MIT的小鼠肺组织炎症更加明显。结论ICH后分泌MIT加重ICH肺部炎症产生。