研究背景:自身免疫性疾病(Autoimmune diseases,AIDs)是由于免疫系统的异常激活而错误的攻击自身正常组织和器官的炎症性疾病。据统计,自身免疫性疾病影响了世界上约10%的人口,已经成为一个全球性的健康问题。Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)是构建人体免疫系统的第一道防线,具有高度保守的模式识别受体。Toll样受体的异常激活可以导致多种免疫细胞的过度活化,如:巨噬细胞(Macrophages,Mφs)和树突状细胞(Dendritic cells,DCs)。然而,异常活化的巨噬细胞和树突状细胞释放出致炎因子、趋化因子和共刺激分子等,导致炎症和自身免疫性疾病的发生。活化的CDC42结合蛋白激酶1(Activated cdc42 kinase 1,ACK1)是一种非受体酪氨酸激酶,参与多种信号通路和生理过程。然而ACK1在TLR通路激活、炎症以及自身免疫性疾病发病机制中的作用尚未见报道。因此,深入探究ACK1对炎症及自身免疫病的作用及其机制有望为炎症及自身免疫病治疗提供新的方向。研究目的:研究ACK1对TLR通路介导的巨噬细胞和树突状细胞活化以及对炎症和自身免疫病发病的影响;探究靶向ACK1能否缓解炎症及自身免疫病发病;为炎症及自身免疫病的研究提供靶点参考和新方向。研究方法:1.分析TLR4/TLR7/TLR9通路活化对巨噬细胞和树突状细胞中ACK1表达的影响。(1)体外巨噬细胞和树突状细胞的培养与处理:选用C57BL/6小鼠,取双后肢胫骨和股骨并分离出骨髓细胞。用小鼠重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)诱导 BMDMs;用 GM-CSF 和 重组小鼠白细胞介素4(Recombinant murine IL-4)诱导BMDCs。所有细胞培养均在37℃和5%CO2培养箱中进行。(2)流式细胞术和Western blot检测上述两种细胞中ACK1的表达。2.ACK1对TLR通路介导的巨噬细胞活化的影响:构建高表达ACK1的慢病毒(ACK1-LV)和干扰ACK1表达的慢病毒(RNAi-ACK1-LV),根据操作说明利用上述慢病毒感染BMDMs,适当时间后分析高、低表达ACK1对TLR通路介导的巨噬细胞活化的影响。(1)流式细胞术检测巨噬细胞表面CD86和CD40的表达;(2)ELISA检测细胞上清中致炎因子的含量;(3)收集细胞蛋白,用Western blot检测MAPKs和NF-κB通路活化情况。3.在细胞水平探究靶向ACK1对TLRs通路介导的巨噬细胞和树突状细胞活化的影响。(1)研究ACK1抑制剂AIM-100处理对巨噬细胞和树突状细胞活力的影响:利用不同浓度AIM-100分别处理上述两种细胞24 h和48 h后,通过Cell Titer-LumiTM发光细胞活力检测试剂盒检测两种细胞的活https://www.selleck.cn/products/epz-6438.html力;(2)研究ACK1抑制剂AIM-100处理对TLR通路诱导的巨噬细胞和树突状细胞活化的影响:利用不同浓度AIM-100分别处理巨噬细胞和树突状细胞,2小时后向巨噬细胞和树突状细胞分别加入TLR4/7/9激动剂。检测指标如下:用流式细胞术检测CD40和CD86的表达,用ELISA检测致炎因子的表达情况;1小时后Western blot检测MAPKs和NF-κB通路的活化情况。4.在动物水平探究靶向ACK1对小鼠内毒素休克病情的影响。小鼠内毒素休克模型的建立:以下实验操作均采用选用8周龄雌性C57BL/6小鼠。在高剂量LPS模型中,腹腔注射AIM-100(5、10、20 μg/g)或对照剂,2小时后腹腔注射LPS(37.5 μg/g)。对每只小鼠的存活进行长达3天的监测。在低剂量LPS模型中,腹腔注射AIM-100(5、10、20 μg/g)或对照剂,2小时后进行腹腔注射LPS(10 μg/g)。(1)观察高剂量LPS模型中小鼠的生命体征、活动指数以及存活率并记录分析;(2)观察低剂量LPS模型中小鼠的生命体征,3小时后采集眼球血,检测血清中炎性因子的分泌;(3)观察低剂量LPS模型中小鼠的生命体征,12小时后采集肝脏及肺脏进行HE染色以便观察损伤情况,TUNEL观察肺脏和肝脏细胞凋亡情况;(4)观察低剂量LPS模型中小鼠的生命体征,12小时后采集淋巴结及脾脏,流式细胞术检测其巨噬细胞和树突状细胞的活化情况。5.在动物水平探究AIM-100对TLR7配体IMQ诱导的狼疮小鼠的影响。咪喹莫特诱导的小鼠狼疮模型:C57BL/6雌性小鼠于右耳均匀涂抹咪喹莫特(IMQ),每周三次。抹药后腹腔注射AIM-100(20 μg/g)或对照剂治疗。10周后,处死小鼠,收集眼球血、脾脏以及肾脏进行相对应实验,以观察AIM-100对IMQ诱导的狼疮模型的影响。(1)检测外周血中dsDNA的表达含量;(2)观察asymptomatic COVID-19 infection脾脏肿大程度并称重;(3)肾脏制作HE切片,观察病理变化;(4)用流式细胞术检测巨噬细胞、树突状细胞中CD40和CD86的表达;(5)检测肾脏中肾小球IgG和IgM沉积。结果:1.TLRs上调巨噬细胞和树突状细胞中ACK1的表达。2.过表达ACK1显著促进TLR通路介导的巨噬细胞的活化,而干扰ACK1表达则显著抑制TLR通路介导的巨噬细胞的活化。(1)与对照BMDMs相比,高表达ACK1的BMDMs经LPS、R848或CpG-1826刺激后细胞表面CD86和CD40Alisertib临床试验的表达显著增高,而低表达ACK1的BMDMs经LPS、R848或CpG-1826刺激后细胞表面CD86和CD40的表达显著降低;(2)与对照BMDMs相比,高表达ACK1的BMDMs经LPS、R848或CpG-1826刺激后细胞培养上清中IL-12和TNF-α的含量显著增高,而低表达ACK1的BMDMs经LPS、R848或CpG-1826刺激后细胞培养上清中IL-12和TNF-α的含量显著降低;(3)与对照BMDMs相比,高表达ACK1的BMDMs经LPS、R848或CpG-1826刺激后p38、Erk、JNK和p65的磷酸化显著增强,而低表达ACK1的BMDMs经LPS、R848或CpG-1826刺激后p38、Erk、JNK和p65的磷酸化显著降低。3.ACK1抑制剂AIM-100显著抑制TLRs通路介导的巨噬细胞和树突状细胞活化。(1)AIM-100在浓度低于20 μM时对巨噬细胞和树突状细胞的细胞活力没有明显的影响;(2)AIM-100显著抑制TLRs通路介导的巨噬细胞和树突状细胞活化:与对照剂处理的BMDMs相比,AIM-100处理的BMDMs表面CD86和CD40的表达显著降低,细胞培养上清中IL-6、IL-12和TNF-α的含量显著减少,p38、Erk、JNK和p65的磷酸化显著降低;在BMDCs中也出现了同样的现象。4.药物ACK1抑制剂AIM-100缓解内毒素休克小鼠的病情。(1)AIM-100能够显著降低内毒素休克小鼠死亡率,并随着药物浓度在一定剂量内的增加,小鼠存活率越高;(2)ELISA检测结果显示AIM-100处理的内毒素休克小鼠血清中TNF-α、IL-6和IL-12水平明显低于对照剂处理的内毒素休克小鼠;(3)苏木精和伊红染色(HE)显示AIM-100明显减轻LPS诱导的肝、肺损伤;TUNEL显示AIM-100处理的内毒素休克小鼠肺脏和肝脏细胞凋亡数量相对较少;(4)AIM-100处理的内毒素休克小鼠淋巴结和脾脏中的巨噬细胞和树突状细胞CD86和CD40的表达水平明显低于对照剂处理的内毒素休克小鼠。5.靶向ACK1缓解了 TLR7配体IMQ诱导的狼疮小鼠的病情。(1)经AIM-100处理的IMQ诱导的狼疮小鼠血清中dsDNA的表达含量显著低于对照剂处理的IMQ诱导的狼疮小鼠;(2)对照剂处理的IMQ诱导的狼疮小鼠的脾脏肿大程度和重量显著高于AIM-100处理的IMQ诱导的狼疮小鼠的脾脏;(3)苏木精和伊红(HE)染色显示AIM-100处理的IMQ诱导的狼疮小鼠对淋巴样细胞的浸润和肾脏系膜基质的弥漫性扩张表现出显著的抑制作用;(4)与对照剂处理的IMQ诱导的狼疮小鼠相比,AIM-100处理的IMQ诱导的狼疮小鼠脾脏巨噬细胞和树突状细胞CD86和CD40表达水平降低;(5)与对照剂处理的IMQ小鼠肾脏相比,AIM-100处理的IMQ诱导的狼疮小鼠肾脏显示出相对较少的IgG和IgM沉积。结论:1.TLRs上调巨噬细胞和树突状细胞中ACK1的表达;2.ACK1促进TLRs通路介导的巨噬细胞和树突状细胞的活化;3.靶向ACK1显著抑制TLRs通路介导的巨噬细胞和树突状细胞的活化;4.靶向ACK1可显著缓解炎症及自身免疫病。