研究背景:胃癌作为我国最为常见的消化系统恶性肿瘤之一,其死亡率与发病率一直高居前列,全球有将近一半的胃癌患者在中国。近年来虽然诊疗技术取得较大进步,但是由于胃癌本身的高度异质性以及个体差异导致很多患者的预后仍然不容乐观。铁死亡(Ferroptosis)在2012年才被正式命名的,是区别于传统的细胞自噬、细胞焦亡、细胞坏死和细胞凋亡的一种新型细胞程序性死亡方式。铁死亡的本质是细胞内氧化还原状态失衡,发生铁超载、脂质活性氧(Lipid reactive oxygen species,Lipid ROS)积累,线粒体皱缩破裂,最终诱发细胞死亡。当前,诱导肿瘤细胞发生铁死亡已被证实在癌症治疗方面具有非常巨大的潜力。索拉非尼(Sorafenib)是一种酪氨酸激酶抑制剂,临床上主要用于晚期肝癌的靶向治疗。同时,其作为铁死亡诱导剂也被很多文献报道在包括胃癌在内的多种肿瘤中发挥抑癌作用。然而,最近索拉非尼作为铁死亡诱导剂的地位受到质疑。目前,索拉非尼在胃癌中涉及到铁死亡的研究较少,索拉非尼能否诱导胃癌细胞发生铁死亡仍有待明确。激活转录因子家族多个成员被证实在铁死亡的调控中发挥重要作用,但有关激活转录因子2(Activation transcription factor 2,ATF2)的研究仅有一篇,且ATF2在索拉非尼诱导的铁死亡中的具体作用及相关机制也暂未见报道。因此,本课题旨在探索ATF2在索拉非尼诱导的胃癌细胞铁死亡中的作用以及下游的具体分子调控机制,从而为胃癌的临床治疗提供新策略。方法:在第一部分中,首先利用免疫组化和Western blot检测ATF2在胃癌细胞及组织中的蛋白表达情况,并进一步分析ATF2的表达水平与胃癌患者临床病理参数及术后总生存期的关系。紧接着利用慢病毒对ATF2进行稳定过表达或敲低,通过CCK-8实验,Transwell迁移及侵袭实验来评估其表达水平对胃癌细胞增殖,迁移和侵袭能力的影响。在第二部分中,我们将细胞分为3组,即DMSO对照组,索拉非尼加药组和索拉非尼+Ferrostatin-1共同加药组,分别处理AGS和MGC803细胞24小时,然后在显微镜下观察细胞形态变化。通过检测细胞内总ROS、脂质ROS、MDA以及GSH含量来评估胃癌细胞的铁死亡水平。利用透射电镜观察索拉非尼处理后胃癌细胞线粒体微观结构的变化情况。紧接着通过Western blot及免疫荧光染色检测索拉非尼处理胃癌细胞后ATF2的表达情况。最后,调控ATF2表达水平后检测其对索拉非尼处理胃癌细胞后铁死亡相关指标的影响。在第三部分中,首先通过联合转录组测序(RNA-seq)和染色质免疫共沉淀测Tamoxifen小鼠序(Ch IP-seq)来鉴定ATF2的全基因组DNA结合位点以及潜在的转录靶点,并进一periodontal infection步通过Ch IP-q PCR进行验证。然后,利用免疫共沉淀(Co-ImmuRSL3分子量noprecipitation,Co-IP)实验来检测ATF2下游靶基因与铁死亡关键分子SLC7A11之间的相互作用。利用si RNA敲低靶基因的表达,检测SLC7A11的蛋白稳定性以及胃癌细胞铁死亡相关指标的变化情况。在第四部分中,将裸鼠随机分为四组:sh-Ctrl对照组、sh-ATF2组、sh-Ctrl?+索拉非尼加药处理组和sh-ATF2?+?索拉非尼加药处理组,通过建立裸鼠皮下异种移植瘤模型,在动物水平上评估敲低ATF2表达以及与索拉非尼联合使用对胃癌生长的影响。结果:我们发现ATF2在胃癌细胞和组织中异常高表达,并与淋巴结转移(P=0.003)和TNM分期(P=0.034)显著相关。高表达ATF2的患者的预后明显劣于低表达的患者(Logrank P=0.011),ATF2表达水平是胃癌患者的独立预后因素。敲低胃癌细胞中ATF2的表达水平可以显著抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。索拉非尼可以诱导胃癌细胞发生铁死亡,同时在此过程中还伴随着ATF2的激活。敲低ATF2可促进索拉非尼诱导的胃癌细胞铁死亡水平,而过表达ATF2则显示出相反的结果。在机制上,通过RNA-Seq和Ch IP-Seq,我们发现HSPH1可能是ATF2下游的靶基因,并通过Ch IP-q PCR进行了验证。HSPH1与SLC7A11存在互作关系,并可以通过提高SLC7A11的蛋白稳定性来促进其表达。此外,HSPH1表达的敲低部分逆转了ATF2过表达对索拉非尼诱导的胃癌细胞铁死亡的效应。最后,裸鼠皮下异种移植瘤模型的结果表明敲低ATF2表达联合索拉非尼治疗对胃癌生长的抑制效果最好,敲低ATF2表达能有效提高胃癌对索拉非尼的敏感性。结论:敲低ATF2表达可显著促进索拉非尼诱导的胃癌细胞铁死亡,并增强索拉非尼在体外和体内对胃癌的抑制作用。