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研究目的:明确心肌细胞内不同水平的ROS与细胞死亡的关系,以及PGAM5在ROS诱导的不同细胞死亡中的作用及机制,为今后以PGAM5为靶点进行干预提供理论依据。研究方法:利用不同浓度的t-BHP干预H9c2不同时间,CCK8和流式细胞术检测细胞死亡率和细胞内ROS水平,建立H9c2细胞死亡模型。Seahorse X9细胞能量代谢仪检测H9c2细胞细胞呼吸耗氧率、细胞外呼吸酸化率、实时ATP生成速率和检测线粒体呼吸功能相关指标。采用Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡水平;WesternBlot方法检测cleaved-caspase 3、caspase 1、cleaved-caspase 1、cleaved-GSDMD、RIP1、RIP3、Keap1、PGAM5的表达;Elisa方法检测MLKL、p-MLKL、GPX4、Fe2+、AIFM1和p-AIFM1的表达;qRT-PCR法检测PGAM5 mRNA的表达;免疫荧光法检测PGAM5的定位。构建PGAM5 siRNA干扰质粒,转染H9c2细胞,并在H9c2细胞中验证PGAM5 mRGSK1120212浓度NA和蛋白质的表达变化。抑制PGAM5表达后,利用Western-Blot和Elisa方法观察了对细胞死亡标志物以及p-Drp1-S637和p-Drp1-S616表达的影响,并采用JC-1方法检测了细胞线粒体膜电位水平的变化。研究结果:(1)t-BHP干预浓度为(0,50,75,100,125,150)μmol/L和干预时间为2h可诱导细胞内ROS呈梯度性升高和细胞存活率梯度性降低,成功构建细胞死亡模型。(2)细胞线粒体氧化磷酸化耗氧率和糖酵解耗氧率呈下降趋势,线粒体呼吸功能各项指标显著降低;(0-125)μmol/BI 10773浓度L t-BHP干预后,细胞通过线粒体氧化磷酸化生成ATP的实时速率的比例显著升高,通过糖酵解生成ATP的比例显著降低,150μmol/L t-BHP干预后,通过线粒体氧化磷酸化和糖酵解生成ATP的速率无明显变化。(3)t-BHP从50μmol/L开始诱导细胞凋亡率逐渐升高,从100μmol/L开始诱导cleaved-caspase 3、cleaved-caspase 1、cleaved-GSDMD、Fe2+、LC3 II/I表达升高,pMLKL、GPX4表达降低;t-BHP从125μmol/L开始诱导Keap1、PGAM5表达升高,pAIFM1表达降低。(4)t-BHP<100μmol/L时,PGAM5 mRNA和总PGAM5的表达显著降低,t-BHP≥100μmol/L时,PGAM5 mRNA、总PGAM5和剪切型PGAM5的表达显著升高。t-BHP诱导细胞内ROS水平的升高导致PGAM5Spinal biomechanics从线粒体向细胞质易位,线粒体向核周聚集。(5)抑制H9c2细胞中PGAM5的表达,显著逆转了100μmol/L t-BHP干预组中cleaved-caspase 3、cleaved-GSDMD、RIP1、RIP3、Fe2+、LC3 II/I的表达升高,和p-MLKL的表达降低。以及150μmol/L t-BHP干预组中Keap1的表达降低,和p-AIFM1的表达升高。(6)t-BHP≥100μmol/L时,可诱导H9c2细胞中p-Drp1-S637的表达逐渐升高。抑制PGAM5的表达后,导致p-Drp1-S616的表达显著降低,MMP的水平显著升高。研究结论:(1)t-BHP干预可诱导H9c2细胞内ROS水平升高。H9c2细胞内低水平的ROS即可诱导细胞凋亡的发生,中等水平的ROS开始诱导细胞焦亡、自噬、铁死亡和坏死性凋亡,而诱导氧死亡需要高水平的ROS。(2)随着细胞内ROS水平的升高,PGAM5逐渐从线粒体向细胞质易位,PGAM5 mRNA和总PGAM5蛋白的表达呈先降低再升高的趋势,中等水平的ROS可以诱导剪切型PGAM5蛋白表达升高。(3)PGAM5参与调控细胞内ROS诱导的细胞凋亡、焦亡、铁死亡、自噬和坏死性凋亡和氧死亡。(4)PGAM5通过影响Drp1-S616的磷酸化介导线粒体裂变,进而导致细胞死亡。

目的：基于Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1（Keap1）/核因子E2相关因子2（Nrf2）/抗氧化反应元件（ARE）通路，探讨槲皮素对脂多糖（LPS）诱导急性肾损伤大鼠铁死亡的影响及治疗作用。方法：60只雄性SD大鼠随机分为正常组、模型组、槲皮素高、低(100、10 mg·kg~(-1))剂量组、铁死亡抑制剂（FER1）组（Ferrostatin 1，5 mg·kg~(-1)）、槲皮素高剂量+Nrf2抑制剂（ML385）组（ML385，30 mg·kg~(-1)）。除正常组外各组通过腹腔注射LPS（10 mg·kg~(-1)）制备AKI大鼠模型。造模成功后，各给药组相应剂量药物干预，正常组、模型组给予等量生理盐水，干预周期为3周。生化检测血清肌酐（Scr）、尿素氮（Bun）水平，考察大鼠肾功能；酶联免疫吸附法（ELISA）检测血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量及白细胞介素（IL1-β、IL-6）；检测肾组织Fe~(2+)、丙二Pevonedistat化学结构醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）水平；苏木精-伊红染色(HE)、马松染色(Masson)及高碘酸希夫染色（PAS）法观察肾组织病理形态变化；透射电子显微镜观察线粒体形态变化；免疫荧光法(IF)检测肾组织ROS水平；免疫组化法(IHC)法及实时荧光定量PCR法(RT-PCR)检测Keap1、Nrf2、血红素加氧酶-1（HO-1）、谷胱oncologic outcome甘肽过氧化物酶4（Gpx4）、转铁蛋白受体（TFR1）、KIM-1蛋白及mRNA表达。结果:与正常组相比，模型组大鼠血清Scr、Bun、TNF-α、IL-1β、IL-6，肾组织Fe~(2+)、MDA含量均显著升高，SOD、GSH含量明显降低（P<0.01）；大鼠肾组织病理损伤严重；线粒体铁死亡特征性损伤明显且数量减少；肾组织ROS水平明显上升；肾组织中Keap1、TFR1、KIM-1蛋白及mRNA表达明显升高，Nrf2、HO-1、Gpx4表达明显降低（P<0.01）。与模型组比较，槲皮素各剂量组及FER1组血清Scr、Bun、TNF-α、IL-1β、IL-6，肾组织Fe~(2+)、MDA水平呈现不同程度的降低，SOD、GSH含量显著增强（P<0.05）；大鼠肾组织病理损伤得到明显缓解；线粒体损伤好转且数量增多；肾组织ROS水平显著降低；肾组织Keap1、TFR1、KIM-1蛋白及mRNA水平明显降低，Nrf2、HO-1、Gpx4表达升高明显，其中槲皮素高剂量组损伤改善最明显（P<0.05）。与槲皮素高剂量组相比，ML385组可明显削弱槲皮素对AKI大鼠的保护作用（P<0.05）。结Regorafenib论：槲皮素可有效抑制AKI大鼠铁死亡，改善肾组织损伤、修复大鼠肾功能，其机制或与激活Keap1/Nrf2/ARE通路有关。

目的：观察清化饮对慢性萎缩性胃炎(CAG)大鼠胃上皮NOD样受体蛋白3(NLRP3)/Blebbistatin使用方法胱天蛋白酶-1(Caspase-1)/消皮素D(GSDMD)细胞焦亡通路的影响，探讨清化饮治疗CAG的可能机制。方法：随机将大鼠分为空白www.selleck.cn/products/PD-0325901对Biochemical alteration照组(n=8)及造模组(n=28)，采用“氨水+去氧胆酸钠+乙醇法灌胃+高脂高糖饮食+人工气候箱饲养”复合法建立病证结合CAG大鼠模型，造模成功后将其随机分为模型组、维酶素治疗组和清化饮治疗组(n=8)。采用HE染色观察大鼠胃黏膜病变情况，Real-time PCR法检测胃组织NLRP3、Caspase-1、β-catenin、GSDMD mRNA表达情况，ELISA法检测血清IL-1β、IL-6、IL-18水平。结果：与空白对照组相比，模型组大鼠炎症细胞浸润明显，胃黏膜固有腺体萎缩，胃黏膜组织中NLRP3、Caspase-1、β-catenin mRNA表达水平显著升高(P＜0.01)，GSDMD mRNA表达水平显著降低(P＜0.01)；血清IL-1β、IL-6、IL-18含量显著上升(P＜0.01)。与模型组比较，清化饮治疗组胃黏膜固有腺体萎缩情况及炎症程度明显改善，NLRP3、Caspase-1、β-catenin mRNA表达蛋白表达水平均显著下降(P＜0.01)，GSDMD mRNA表达水平上升(P＜0.01)；血清IL-1β、IL-6、IL-18含量显著下降(P＜0.01)。结论：清化饮可有效改善CAG大鼠胃黏膜组织病理改变，其机制可能与调控NLRP3/Caspase-1/GSDMD信号通路，抑制细胞焦亡，从而降低胃黏膜炎症水平有关。

目的 探讨缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)/基质细胞衍生因子-1 (SDF-1)通路对缺氧预处理大鼠模型的作用。方法 76只成年雄性SD大鼠，通过在低压氧舱(海拔5000 m)和西宁市(海拔2260 m)饲养建立缺氧预处理动物模型，随机分为6组：对照组(Ctrl组),高海拔缺氧预处理1 d组(HHP-1d),高海拔缺氧预处理4 d组(HHP-4d)、高海拔缺氧预处理15 d组(HHP-15d),高海拔缺氧预处理30 d组(HHP-30d),中海拔缺氧预处理组(MHP),其中Ctrl组、HHP-4d组、HHP-30d组与MHP组利用7.0 T小动物MRI,T2加权像(Twww.selleck.cn/products/cx-54612WI)观察颅内结构及基底动脉直径，连续性自旋动脉标记(ASL)观察海马区及脑干区脑血流，检测各组大鼠血常规，ELISA检测各组大鼠血清HIF-1α和SDF-1浓度及血浆血小板活化因子(PAF)及P-选择素(SELP)浓度。结果 缺氧预处理条件下，颅内结构未见明显异常；基底动脉直径增宽，但无统计学意义；脑干区及海马区脑血流量明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05),红细胞及白细胞升高，血小板下降，差异具有统计学意义(P<0.05),其中MHP组红细胞和血小板接近Ctrl组；缺氧预处理组HIF-1α浓度明显升高，SDF-1浓度(除HHP-1d组外)明显升高，HHP-1d、HHP-15d组PAF、SELP浓度明显升高，HHP-4d、HHP-30d组PAF浓度明显下降，HHP-4d组SELP浓度明显下降，差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论 缺氧预处理可通过HIF-1α/SDF-1通路增加机体氧储备量及免疫防御力，提高脑储备能力并发挥脑保护作用，其中以中海拔(海拔PCR Reagents2260 m)饲养30 d预处理效GSKJ4试剂果最佳。

背景:色素沉着绒毛结节性滑膜炎(pigmented villonodular synovitis,PVNS)是一组发病原因不明的介于炎症与良性之间的慢性滑膜增生性病变,好发于膝关节。本病目前治疗以手术切除病变滑膜为主,但是残留滑膜所致术后复发仍是临床Dolutegravir分子量一大难题,严重影响患者生活质量与预后。目的:研究并提出一种治疗膝关节色素沉着绒毛结节性滑膜的新型手术方式与理念:关节镜下全滑膜剥除术(arthroscopic total synovial peel,ATSP)。从组织解剖学的角度上提出关节镜下全滑膜剥除术的手术界面理论,并分析比较其与开放或者其他常规关节镜下滑膜切除术的有效性和疗效差异。从而为膝关节色素沉着绒毛结节性滑膜炎的手术治疗提供一种新的理念依据。方法:回顾性研究并分析南方医科大学珠江医院关节骨病外科在2014年3月至2020年7月期间,由林荔军主任诊疗组收治的19例(男6例,女13例)膝关节弥漫性色素沉着绒毛结节性滑膜炎(diffuse pigRSL3mentation villous nodular synovitis,DPVNSantibiotic selection)的病人。均由同一关节镜手术经验丰富的高年资医师进行关节镜下全滑膜剥除术手术治疗,术后按照统一的康复流程与方案进行康复治疗。记录和收集患者的一般资料、定期随访跟踪患者预后、功能恢复情况。根据患者术后多次随访的症状、体征、磁共振(MRI)检查及是否具有二次手术后病理结果来判断并计算患者术后复发率。并与目前文献中所报道术后复发率进行对比,评价其疗效及有效性。术前和末次随访时采用疼痛视觉模拟分数(the visual analog score,VAS)、膝关节Lysholm功能评分对患者疼痛及膝关节功能进行评估,结果使用SPSS25.0统计软件进行配对t检验进行统计分析,取标准值α=0.05,p<0.05,表示差异有统计学意义。结果:本研究共纳入19例膝关节弥漫性色素沉着绒毛结节性滑膜炎患者,均为单侧膝关节病变,4例(21.1%)有外伤史。其中女性13例(68.4%),男性6例(31.6%),右膝患病10例(52.6%),左膝9例(47.4%)。患者年龄6-78岁,平均39.8岁,病程20天-10年,平均23.9个月。所有患者均由同一关节镜手术经验丰富的高年资医师进行关节镜下全滑膜剥除手术治疗,术后随访时间24-84个月,平均48个月,末次随访时间为2022年8月19日。19例患者术后及随访过程中均无明显伤口愈合不良、感染,膝关节僵硬、活动度差等并发症。仅有1例患者随访过程中发现复发,经二次手术和术后病理诊断证实。19例患者术后总复发率为5.26%。末次随访时(2022年8月19日)膝关节VAS评分为(1.47±1.172),低于术前(4.89±2.158),差异有统计学意义(t=11.824,p<0.001);末次膝关节Lysholm评分(89.16±8.751),其中评分优者6例(31.6%),良 7 例(36.8%),中 6 例(31.6%),差 0 例(0%);并且高于术前(61.47±15.816),差异有统计学意义(t=6.617,p<0.001)。结论:关节镜下全滑膜剥除法对膝关节色素沉着绒毛结节性滑膜炎的治疗效果真实可靠,较膝关节开放滑膜切除术和常规关节镜下滑膜切除术复发率更低,且术后膝关节功能恢复更好、更快,提出一种新的手术思路和方法,值得临床推广。

水稻(Oryza sativa L.)是世界上重要的粮食作物之一,也是我国第一大口粮作物。淀粉作为水稻种子中最重要的组成部分,决定了稻米的产量和品质。淀粉的生物合成是一个复杂的酶促反应过程,目前多个淀粉合成酶类基因已被克隆,然而其调控机制还有待进一步深入研究。抽穗期作为水稻重要的农艺性状,不Dorsomorphin说明书仅决定了水稻品种的种植范围,而且影响着稻米的产量。挖掘调控水稻抽穗期关键基因,解析抽穗期调控网路,可以为水稻品种改良提供基因资源和理论依据。bZIP转录因子广泛分布于高等植物中,是一类极其重要的转录调控因子,参与调节植物的生长发育、信号传导和逆境胁迫等。目前为止,关于bZIP转录因子同时调控水稻淀粉合成和抽穗期的作用机制仍尚未报道。本研究中以bZIP34转录因子为研究对象,构建敲除突变体和过表达株系,解析了bZIP34参与调控水稻淀粉合成和抽穗期的作用机制。主要研究结果如下:1、转录因子bZIP34的特性分析。RT-qPCR结果表明转录因子bZIP34在胚和胚乳中高表达,且随着胚乳的发育,bZIP34的表达量逐渐升高,到开花后21 d开始下降。烟草叶片瞬时表达实验表明bZIP34定位于细胞核。bZIP34在酵母中没有自激活活性,可以与自身形成同源二聚体。水稻原生质体瞬时表达实验表明转录因子bZIP34具有转录抑制活性。2、实验材料的创建。在中花11背景下,利用CRISPR/Cas9技术对bZIP34的第一外显子进行基因编辑。通过测序鉴定出两个缺失A和缺失C的纯合突变体。单碱基的缺失导致移码翻译,产生一个含有138个氨基酸的蛋白质,其中位于C端的bZIP结构域完全缺失。将Ubi-bZIP34-GFP载体转入中花11获得过表达株系,通过mRNA水平的鉴定获得了bZIP34表达量分别增高7倍和10倍的两个株系。3、敲除突变体和过表达株系的籽粒表型分析。突变体糙米的粒长显著增加,粒厚显著降低,粒宽没有显著变化。过表达株系糙米的粒长、粒宽和粒厚均显著降低。千粒重统计结果显示bZIP34敲除突变体的粒重没有显著变化,过表达材料的粒重显著降低。突变体的总淀粉、可溶性糖和表观直链淀粉含量没有显著变化,过表达材料的总淀粉含量下降34%,可溶性糖含量下降43%,表观直链淀粉含量下降42%。4、bZIP34调控淀粉合成相关基Transmission of infection因的表达。RT-qPCR检测淀粉合成相关基因的表达水平,结果显示突变体中AGPS2b、GBSSI和ISA2的表达量显著升高,AGPL2的表达量降低。过表达材料中 AGPL2、AGPS1、AGPS2b、GBSSI、SSI、SSⅢa、SBE1、SBE3、ISA1和ISA2的表达量显著下调。Western blot结果显示突变体中GBSSI和SBE1的蛋白表达水平没有显著变化,过表达材料中GBSSI和SBE1的蛋白表达水平显著降低。5、bZIP34直CCRG 81045细胞培养接结合GBSSI和SBE1的启动子元件。酵母单杂交实验表明bZIP34能够直接结合GBSSI和SBE1启动子。EMSA实验结果表明bZIP34可以直接结合GBSSI启动子上的A-Box和SBE1启动子上的ACGT元件。转录因子bZIP34通过直接调控淀粉合成相关酶基因GBSSI和SBE1的表达,进而调控胚乳淀粉合成。6、bZIP34是一个水稻抽穗抑制因子。抽穗期统计结果显示,bZIP34被敲除之后几乎不影响水稻抽穗期,而bZIP34过表达植株的抽穗时间比野生型晚20 d。将Ubi-bZIP34-GFP载体转入拟南芥中,发现拟南芥抽薹延迟。以突变体和过表达株系在LD和SD条件下处理40 d的叶片为材料,RT-qPCR检测水稻抽穗关键基因的表达量,结果显示过表达材料中PHYB和Hd1的表达量没有显著变化,Ehd1、RFT1和Hd3a的表达量均显著下降。酵母单杂实验结果显示bZIP34不能直接结合Ehd1的启动子。上述结果说明bZIP34间接调控Ehd1、RFT1和Hd3a的表达,从而延迟水稻抽穗。综上所述,本研究发现bZIP34通过直接结合GBSSI和SBE1启动子上的顺式作用元件调控水稻胚乳淀粉的合成,并且可以间接的调控抽穗基因Ehd1、RFT1和Hd3a的表达来延迟水稻抽穗。研究结果将进一步丰富和充实bZIP家族转录因子参与调控植物生长发育的作用机制,为水稻抽穗期育种和品质改良提供一定的理论基础。

癌症和细菌感染一直是威胁人类健康的重大基础疾病。近年发展起来的纳米催化医学,借助于纳米材料的本征化学NVP-TNKS656特性催化调控活性氧物种(Reacplant pathologytive oxygen species,ROS)产生或其他化学反应,实现了疾病的高效以及特异性治疗。然而,不论是肿瘤细胞还是细菌都具有完整的抗氧化系统,用于抵御氧化应激,维持自身的氧化还原稳态。当纳米药物催化产生的ROS攻击目标受体时,癌细胞和细菌不断地提升抗氧化水平来清除过量产生的ROS,这严重阻碍了纳米催化药物在对抗细菌感染和肿瘤治疗过程中ROS的杀伤效果。因此借助纳米催化材料并利用病灶微环境加速ROS生成,将有利于提高基于ROS的疾病治疗效果,并对纳米催化药物的临床转化研究具有重要意义。基于此,本论文聚焦疾病病灶微环境对ROS调控的需求,设计制备了三种促ROS生成的功能纳米材料,实现了高效的抗菌和抗肿瘤治疗。具体的研究内容如下:(1)自催化亚铁重生策略用于细菌感染高效治疗。调控芬顿反应进程是ROS治疗的关键策略,而Fe~(3+)到Fe~(2+)的转变作为限速步骤,严重阻碍了ROS的产生及其抗菌效应。因此,本研究构建了Fe Se_2纳米片用于维持芬顿反应过程中Fe~(2+)的重生,保持高ROS生成效率进而促进有效的细菌杀伤。当Fe~(2+)和H_2O_2反应生成Fe~(3+)和·OH后,Se~(2-)将Fe~(3+)还原为Fe~(2+),从而维持芬顿反应高效运行。除此之外,Se物种还可以与H~+结合生成H_2Se,进一步与O_2反应生成O_2~(·-)。Fe Se_2自催化过程产生的Fe~(2+)/O_2~(·-)与芬顿反应生成的·OH共同作用,通过打破细菌的氧化阈值,来破坏细菌膜、引发脂质过氧化以及消耗谷胱甘肽(Glutathione,GSH),进而诱导细菌的不可逆损伤。Fe Se_2的抗菌能力加速了细菌感染的伤口愈合进程。这种Fe~(2+)再生调控的氧化应激为广谱非抗生素抗菌供了一种加速且持续的ROS增强策略。(2)谷胱甘肽消耗协同活性氧增强用于“类铁死亡”肿瘤治疗。癌细胞中高表达的抗氧化物质GSH严重限制了ROS的产生效率。基于此,本研究构建了钼酸钴-磷钼酸复合纳米片(Co Mo O_4-phosphomolybdic acid,CPMNSs),以消耗GSH为前提,用于增强ROS的产生。CPMNSs中高价态的Mo~(6+)可以和GSH反应,有效消耗GSH。而Mo~(6+)转变生成的Mo~(5+)可以通过多金属氧酸盐结构驱动罗素机制,催化H_2O_2分解产生~1O_2。同时,GSH与Mo~(6+)的氧化还原反应还促进了CPMNSs的降解,从而加速Co离子的释放,推动了类芬顿反应中·OH的产生效率。GSH的消耗不仅使谷胱甘肽过氧化物酶4(Glselleck Y-27632utathione peroxidase,GPX4)失活,而且促进了~1O_2和·OH的产生,使脂质过氧化物累积。体内和体外结果都证明了CPMNSs具有良好的诱导癌细胞铁死亡的能力。这种非铁基纳米材料诱导“类铁死亡”策略扩展了纳米催化癌症治疗的研究思路。(3)谷胱甘肽重生抑制协同活性氧产生用于铁死亡肿瘤治疗。当GSH被消耗后,其氧化态的GSSG能够在谷胱甘肽还原酶的作用下接受还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)的电子重新转变为GSH,恢复抗氧化能力。为此,本研究构建了Pt-MIL-101(Fe)纳米药物,用于催化NADPH氧化以及后续的级联反应,以产生·OH并阻止GSH重生,从而促进癌细胞对铁死亡的敏感。在级联反应过程中,具有NADPH氧化酶(NADPH oxidase,NOX)活性的Pt-MIL-101首先催化NADPH将电子转移至O_2,从而产生O_2~(·-);然后利用其类超氧化物歧化酶活性,催化O_2~(·-)歧化产生H_2O_2;产生的H_2O_2进一步作为底物,通过与MIL-101结构中心的Fe~(3+)/Fe~(2+)进行芬顿反应,进而生成高毒性的·OH。NOX的类酶特性催化NADPH的消耗,很大程度上阻止了GSH的再生,并使GPX4失活,从而抑制了脂质过氧化物的还原。而通过级联反应生成的·OH和O_2~(·-)促进了癌细胞脂质过氧化物的产生。这种NADPH级联消除策略双重保障了脂质过氧化物的累积,加速了肿瘤铁死亡的发生。

脓毒症是因宿主对感染反应失调而导致的危及生命的器官功能障碍症候群,是重症监护病房住院患者死亡常见原因之一。长时间以来,肠道被认为在脓毒症的发生发展过程中起着至关重要的作用,是引起多器官功能障碍综合征的“motor”。肠道是机体和外部环境之间的防御屏障,能够阻止肠道内有毒介质和病原体进入循环。脓毒症期间肠道屏障受损使细菌和内毒素移位,并对远端器官结构和功能产生有害影响,导致多器官功能障碍综合征。右美托咪定(dexmedetomidine,Dex)是一种高效、高选择性的α2肾上腺素能受体激动剂,具有良好镇静、易于唤醒而不引起明显呼吸抑制的作用,能显著减少病人术后谵妄,目前广泛应用于重症和围手术期患者。近年来右美托咪定对脓毒症器官功能的保护作用成为研究热点,有文献报道右美托咪定对脓毒症引起的肠道屏障损伤具有一定保护作用,但其对脓毒症肠道屏障功能发挥保护作用的机制如何?目前尚不清楚。巨噬细胞是肠道免疫屏障的重要组成部分,能启动并协调对突破肠上皮屏障的细菌产生有效免疫反应。大多数驻留的肠道巨噬细胞由血单核细胞补充。生理条件下,血液来源的单核细胞在肠道逐渐获得抗炎巨噬细胞的组织驻留表型,即M2巨噬细胞,通过分泌抗炎因子如IL-10等限制炎症。在脓毒症期间,机体处于炎症状态,血源性单核细胞在肠道则获得更多的促炎表型,即M1巨噬细胞,分泌高水平的炎症细胞因子TNF-α、IL-1β等,影响肠上皮细胞间紧密连接蛋白的表达和定位。有研究证明,M2型巨噬细胞促进肠上皮屏障的紧密性,而M1型巨噬细胞诱导肠屏障通透性增加。因此,巨噬细胞的极化表型与脓毒症肠道屏障功能密切相关。Dex是否通过调控巨噬细胞极化表型发挥对脓毒症肠道屏障功能的保护作用呢?不清楚。据此,本研究采用盲肠结扎穿孔术(cecal ligation and puncture,CLP)制备脓毒症模型以及脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)处理的肠上皮细胞(intestinal epithelial cell,IEC)和RAW264.7细胞模型,分别从在体水平及离体水平研究右美托咪定对脓毒animal models of filovirus infection症大鼠肠道屏障功能的保护作用及机制,研究内容包括以下两部分:(1)右美托咪定对脓毒症大鼠肠道屏障功能的保护作用(2)右美托咪定调控巨噬细胞极化发挥肠道屏障保护的机制研究。研究内容:第一部分右美托咪定对脓毒症大鼠肠道屏障功能的保护作用1.右美托咪定对脓毒症大鼠肠道通透性的影响制备CLP脓毒症模型,通过测定肠组织伊文思蓝(evans blue,EB)渗漏,ELISA法检测血清D-乳酸(d-lactic acid,D-lac)、二胺氧化酶(diamine oxidase,DAO)含量和炎症细胞因子TNF-α、IL-1β水平,以及HE染色观察肠组织病理结构情况,观察脓毒症后肠道屏障的损伤及Dex对脓毒症大鼠肠道通透性的影响。2.右美托咪定对脓毒症肠上皮细胞通透性的影响LPS刺激IEC复制脓毒症模型,采用免疫荧光染色和蛋白质印迹法(western blot,WB)检测IEC紧密连接蛋白ZO-1和Occludin的表达,观察Dex对IEC通透性的影响。3.右美托咪定对脓毒症大鼠器官功能的影响检测脓毒症大鼠平均动脉压(mean arterial pressure,MAP),并取大鼠外周血分别检测血气、肝功能(谷丙转氨酶,ALT;谷草转氨酶,AST)、肾功能(肌酐,Crea)和心肌酶谱(肌酸激酶同工酶,CK-MB),观察Dex对脓毒症大鼠心肝肾等重要器官功能的保护作用。4.右美托咪定对脓毒症大鼠存活时间及存活率的影响制备CLP脓毒症Vorinostat分子式模型,观察Dex对脓毒症大鼠24h存活时间和存活率的影响。第二部分右美托咪定调控巨噬细胞极化发挥肠道屏障保护的机制研究1.右美托咪定对脓毒症大鼠肠道巨噬细胞极化的影响通过CLP建立脓毒症模型,提取脓毒症大鼠肠组织制备成单细胞悬液,采用流式细胞术分选鉴定肠组织单细胞悬液中巨噬细胞极化类型亚型(CD86标记M1型巨噬细胞,CD206标记M2型巨噬细胞);利用免疫荧光染色标记脓毒症大鼠肠组织冰冻切片,观察肠组织中M1型巨噬细胞的含量,观察Dex对脓毒症大鼠肠组织巨噬细胞极化类型的影响。2.右美托咪定对LPS刺激的RAW264.7细胞极化的影响利用LPS刺激RAW264.7细胞复制脓毒症模型,采用免疫荧光染色、ELISA和WB检测M1、M2巨噬细胞相关标志物的表达,i NOS、TNF-α、IL-6、IL-β标记M1型巨噬细胞,用CD206和Arg1标记M2型巨噬细胞。3.代谢组学分析利用代谢组学对RAW264.7细胞内所有代谢物进行定量分析,使用KEGG分析对差异代谢物进行通路富集。4.右美托咪定调控巨噬细胞极化的机制根据代谢组学结果,采用ELISA法检测RAW264.7细胞代谢物谷胱甘肽(glutathione,GSH)含量,WB检测x CT和谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)的表达。同时用荧光探针观察Dex对活性氧ROS和Lipid ROS的影响。明确Dex是否通过影响x CT表达,促进GSH生成并激活GPX4,抑制巨噬细胞发生铁死亡,进而调控巨噬细胞极化类型。研究结果:第一部分右美托咪定对脓毒症大鼠肠道屏障功能的保护作用1.右美托咪定对脓毒症大鼠肠道通透性的影响脓毒症后大鼠肠道通透性升高,表现为肠组织EB渗漏明显增加,D-lac和DAO含量显著升高,血清炎症因子TNF-α、IL-1β水平明显增加,肠绒毛萎缩、断裂,大量红细胞和炎性细胞浸润;Dex治疗后,可以明显降低脓毒症大鼠肠道通透性,肠组织EB渗漏明显减少,血D-lac和DAO含量显著下降,炎症细胞因子TNF-α、IL-1β水平也明显降低,肠绒毛萎缩情况明显好转,红细胞及炎性细胞浸润减少。2.右美托咪定对脓毒症肠上皮细胞通透性的影响LPS刺激后IEC通透性显著增加,表现为ZO-1和Occludin表达减少,免疫荧光结果显示ZO-1表达减弱且明显断裂,成松散分布;经Dex处理后,IEC通透性显著改善,ZO-1和Occludin表达增加,免疫荧光示ZO-1表达明显增加,分布较连续和清晰。3.右美托咪定对脓毒症大鼠器官功能的影响脓PF-07321332核磁毒症术后大鼠肝肾及心肌功能损伤严重,动脉血压下降明显,p H与Pa O2均显著降低,Pa CO2显著升高;Dex治疗后,脓毒症大鼠肝肾及心肌功能损伤显著减轻,动脉血压升高,Pa O2与p H均显著升高,Pa CO2显著降低。4.右美托咪定对脓毒症大鼠存活时间及存活率的影响经脓毒症术后,大鼠的生存时间缩短,生存率大大降低;Dex治疗后,大鼠存活率显著增加,存活时间显著延长。第二部分右美托咪定调控巨噬细胞极化发挥肠道屏障保护的机制研究1.右美托咪定对脓毒症大鼠肠道巨噬细胞极化的影响脓毒症组大鼠肠道促炎M1型巨噬细胞数量增多,肠组织单细胞悬液内CD86(+)CD206(-)巨噬细胞显著增加,i NOS表达增加,提示脓毒症后肠道巨噬细胞主要向M1型极化;Dex治疗后,肠单细胞悬液内CD86(+)CD206(-)巨噬细胞数量明显减少,CD86(-)CD206(+)巨噬细胞数量明显增多,i NOS表达减少,提示Dex能抑制脓毒症肠道巨噬细胞向M1型极化,促进其向M2型极化。2.右美托咪定对LPS刺激的RAW264.7细胞极化的影响LPS刺激后巨噬细胞向M1型极化明显,表现为i NOS表达显著增多,炎症细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β水平增加;Dex处理后,i NOS表达明显减少,CD206和Arg1表达明显增加,这表明巨噬细胞向M1极化减少,而向M2表型极化增多。3.代谢组学分析代谢组学质谱分析结果显示Dex组和LPS组之间有274种差异代谢物,其中半胱氨酸和谷胱甘肽差异显著,用KEGG富集方法,对差异代谢物进行分析,结果发现半胱氨酸和谷胱甘肽与铁死亡通路密切相关。提示Dex治疗后可能通过调控铁死亡通路相关代谢产物,参与巨噬细胞极化调控。4.右美托咪定调控巨噬细胞极化的机制LPS刺激后,RAW264.7细胞内GSH含量下降,x CT和GPX4蛋白水平显著降低,ROS和Lipid ROS明显增加,巨噬细胞发生铁死亡;Dex处理后,GSH含量增多,x CT和GPX4表达明显增加,细胞内ROS和Lipid ROS均减少,表明Dex能减轻LPS引起的巨噬细胞铁死亡,进而抑制巨噬细胞向M1型极化。研究结论:1.Dex对脓毒症大鼠肠道屏障功能具有保护作用,通过抑制炎症反应,增加肠上皮细胞间紧密连接蛋白的表达,显著降低肠道通透性,同时脓毒症大鼠其他器官功能也受到了Dex的保护,最终改善了大鼠存活时间和生存率。2.Dex能明显减少脓毒症大鼠肠道炎性M1巨噬细胞数量,促进巨噬细胞向抗炎M2型极化,抑制炎症细胞因子分泌,进而发挥对脓毒症大鼠肠道屏障功能的保护作用。3.Dex通过影响转运蛋白x CT,增加巨噬细胞内GSH含量和GPX4的表达,从而减少胞内ROS和Lipid ROS水平,减轻巨噬细胞铁死亡,进而抑制巨噬细胞向促炎M1型极化。

目的 揭示H1连接子组蛋白基因（H1 linker histone gene,hil-1）的生理学功能，以及其调控线虫寿命的分子机制。方法 以秀丽隐杆线虫为模式生物，采用RNA干扰菌喂食、hil-1(gk229)突变体回交纯化以及过表达质粒显微注射技术来敲降、敲除以及过表达hil-1基因，然后观察线虫存活寿命及产卵情况，通过热耐受实验、百草枯应激实验和重金属Cr~(6+)应激实验评价hil-1(gk229)突变体的抗逆性，利用实时荧光定量PCR实验以及构建双突变体线虫进一步确定hil-1调控寿命所关联的信号通路和作用靶点。结果 与野生型N2线虫相比，RNA干扰后的线虫寿命以及hil-1(gk229)突变体线虫寿命明显缩短（P<0.001），而hil-1全身性过表达后线虫寿命延长（P<0.05）。与野生型N2线虫相比，hil-1(gk229)突变体线虫对热压力和氧化压力的耐受性明显降低（P<0.001,P<0.05），而对重金属的耐受能力无差异（P>0.05）。并且，相比于野生型N2线虫，hil-1(gk229)突变体线虫的发育周期缩短（P<0.001），产卵提前（P<0.001），但产卵总量没有显著变化（P>0.05）。给eat-2(ad465)突变体线虫喂食hil-1 RNA干扰菌后，hil-1表达下调不影响eaMedicine traditionalt-2(ad465)突变体线虫的寿命（P>0.05）。相较于野生型N2线虫，hil-1(gk229)突变体线虫中daf-16表达水平明显下调（P<0.001），其下游基因mtl-1和ctl-1表达也下调（P<0.05,P<0.001）。与daf-2(e1370)突变体相比，daf-2(e1370);hil-1(gk229)双突变体线虫的寿命无明显变化（P>0.05）；而与daf-16(mu 86)突变体相比，daf-16(mu86);hil-1(gk229)双寻找更多突变线虫的寿命VX-445小鼠明显缩短（P<0.001）。与对照组相比，在表皮和肠道中RNA干扰hil-1基因表达后线虫寿命明显缩短（P<0.001）。结论 hil-1基因缺失明显缩短线虫寿命，同时使线虫对热压力和氧化压力的耐受性降低。hil-1基因可能通过饮食限制信号通路调控秀丽隐杆线虫的寿命，且该作用主要在表皮和肠道。

研究背景:阿霉素(Doxorubicin,DOX)是一种有效的抗肿瘤蒽环类药物,广泛应用于卵巢癌、乳腺癌、白血病等各种实体肿瘤和血液系统恶性肿瘤的治疗,在各种化疗方案中发挥不可替代的作用。阿霉素通过嵌入DNA的相邻碱基对之间,抑制拓扑异构酶II影响DNA的复制和转录,从而达到杀死肿瘤细胞的作用。然而与肿瘤细胞不同,心肌细胞是高度分化的终末细胞,特别容易受到此类毒性药物的影响,心脏特异性心磷脂对阿霉素有较高的亲和力,使其更容易在心脏富集,同时对血管内皮细胞造成严重损害。随着累积剂量的增加会产生急性或慢性心脏毒性(Doxorubicin-induced CardiBMS-354825试剂otoxity,DIC),造成心律失常、不可逆的心肌损伤、扩张型心肌病,严重时可出现充血性心力衰竭,目前这类心血管事件已成为患者非癌症相关死亡的主要原因。阿霉素诱导心脏毒性的机制较为复杂,其中氧化应激与铁死亡发挥重要作用。铁死亡(Ferroptosis)是一种铁依赖性的以脂质过氧化物积累和抗氧化物质减少为特点的程序性细胞死亡。阿霉素进入机体后,通过与一氧化氮合酶(NOS)和烟酰胺腺嘌呤磷酸二核苷酸(NADPH)氧化酶作用,产生大量活性氧自由基(ROS),同时伴随抗氧化酶的减少引起氧化应激。另一方面阿霉素与铁形成络合物并催化过氧化氢(H2O2)转化cancer and oncology为羟基自由基,从而导致活性氧的产生。此外,阿霉素与铁的络合物通过调节铁相关蛋白,使不稳定铁池增加,并介导细胞膜磷脂中多不饱和脂肪酸(PUFA)发生脂质过氧化反应,进而使心肌细胞诱发损伤或铁死亡。临床上采用多种药物治疗方式来降低阿霉素心脏毒性风险,但是心脏毒性的发生风险仍然很高。有氧运动作为一种安全有效的非药物辅助治疗方式,在癌症患者的康复计划中必不可少。临床前研究也表明,运动可以减轻甚至逆转心脏毒性,而且不会损害阿霉素的抗肿瘤疗效。但是有氧运动能否通过抑制细胞铁死亡改善阿霉素诱导的心脏毒性,尚未可知。研究目的:本研究以阿霉素诱导产生心脏毒性的小鼠为研究对象,探讨有氧运动对阿霉素心脏毒性及细胞铁死亡的影响,以期为研究运动改善化疗患者心脏毒性的机制提供证据,为支持运动作为一种非药物辅助疗法提供理论依据。研究方法:将4月龄雌性BALB/C小鼠随机分为安静对照组(C,n=10)、阿霉素组(D,n=10)、运动对照组(CE,n=12)、阿霉素+运动组(DE,n=10)。通过每周1次腹腔注射阿霉素,注射剂量为5mg/kg,连续4周,累积剂量20mg/kg,建立小鼠阿霉素心脏毒性模型。对照组按同等剂量注射0.9%生理盐水。在小鼠完成一周的跑台运动适应性训练后,进行最大摄氧量测试,最终确定以50%最大摄氧量强度进行跑台运动干预。有氧运动干预方案为热身10min*10m/min,正式训练40min*12m/min,放松10min*10m/min,60min/d,5d/w,共干预4周。运动干预在阿霉素第一次注射24小时后进行,对照组小鼠在笼中进行正常的活动。运动干预结束后24小时,进行超声心动图检测及最大摄氧量测试,48小时后取各组小鼠心脏及血液。通过计算心脏/胫骨长(HW/TL),评估小鼠心肌肥厚;通过超声心动过图检测小鼠心脏功能,用1.5%异氟烷对小鼠进行麻醉,并使用小动物超声心电图机和23 MHz探头进行成像。采用乳头肌水平的长轴、短轴视图心脏2D、M模式,测试心脏2D、M模式,取连续三个心动周期的平均值获得左室射血分数(LVEF)和左室短轴缩短率(LVFS);ELISA检测血清中肌钙蛋白(c-TnT)、N端脑钠肽前体(NT-pro-BNP),以评估心肌损伤及心力衰竭;通过HE染色观察心肌组织病理变化;通过Western blot检测SLC7A11、GPX4、Nrf2、Tf R1的表达水平,评估细胞铁死亡。研究结果:(1)HW/TL各组小鼠之间没有显著差异(p>0.05),说明注射DOX没有产生心肌肥厚;(2)与C组相比,D组LVEF、LVFS显著降低;与D组相比,DE组LVEF、LVFS显著提高(p<0.05),说明有氧运动可以缓解阿霉素导致的小鼠心功能下降。(3)与C组相比,D、DE组的c TNT显著升高(p<0.05),说明阿阿霉素使小鼠心脏收缩功能受损;与C组相比,D组NT-pro-BNP显著性升高(p<0.05),说明阿霉素使小鼠左心室功能降低,并出现心力衰竭;但与D组相比,DE组NT-pro-BNP浓度低,但是并没有显著性差异(p>0.05)。(4)HE染色结果显示C组心肌细胞结构完整,心肌纤维排列整齐,横纹清新,无明显损伤。D组心肌细胞内出现空泡变性,肌原纤维丢失,心肌细胞间隙明显增宽,细胞排列紊乱。与D组相比,DE组有明显改善,说明有氧运动减轻了心肌损伤。(5)与C组相比,D组SLC7A11、GPX4、Nrf2蛋白表达水平显著降低(p<0.05);与D组相比,DE组Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白表达水平显著升高(p<0.05),说明运动降低了细胞铁死亡,但组间比较Tf R1蛋白表达水平并没有显著性差异(p>0.05)。研究结论:有氧运动可以有效改善阿霉素诱导的小鼠心脏毒性,包括提高心脏功能、降低心肌结构损伤以及可能通过上GSK J4价格调Nrf2/GPX4信号通路抑制细胞的铁死亡。