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目的 观察胸苷激酶1在子宫内膜癌中的应用价值。方法 选取2020年1月至2022年10月Etoposide纯度齐齐哈尔医学院附属第二医院收治的48例子宫内膜癌患者(子宫内膜癌组)、52例子宫内膜增生患者(子宫内膜增生组)及50名进行健康体检的健康女性(健康组)为研究对象。transplant medicine观察各组一般资料，比较各组胸苷激酶1水平，比较分析胸苷激酶1在不同子宫内膜癌患者国CP-690550配制际妇产科联盟(FIGO)分期、组织学分级、肿瘤肌层浸润深度中的变化情况。结果 子宫内膜癌组、子宫内膜增生组胸苷激酶1水平高于健康组，子宫内膜癌组胸苷激酶1水平高于子宫内膜增生组，差异有统计学意义(P <0.05)。Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期组胸苷激酶1水平高于Ⅰ期组，Ⅲ、Ⅳ期组胸苷激酶1水平高于Ⅱ期组，Ⅳ期组胸苷激酶1水平高于期Ⅲ期组，差异有统计学意义(P <0.05)。G2、G3组胸苷激酶1水平高于G1组，G3组胸苷激酶1水平高于G2组，差异有统计学意义(P <0.05)。≥1/2组胸苷激酶1水平高于<1/2组，差异有统计学意义(P <0.05)。结论 胸苷激酶1在子宫内膜癌患者中呈高表达，FIGO分期越高则胸苷激酶1水平越高，组织学分级越高则胸苷激酶1水平越高，肿瘤肌层浸润深度越高则胸苷激酶1水平越高。

目的 运用转录组学测序（transcriptome sequencing,RNA-Seq）和生物信息学技术对酸枣仁皂苷A(jujuboside A,JuA)改善淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein,APP）/早老蛋白1(pesenilin 1,PS1)双转基因小鼠认知功能的潜在机制进行分析，并采用qRT-PCR与Western blotting实验进行验证。方法 7月龄APP/PS1双转基因小鼠随机分为模型组及JuA低、中、高剂量（5、10、20 mg/kg,ip）组和多奈哌齐（0.65 mg/kg,ig）组，每日给药1次，连续21 d。采用Morris水迷宫实验检测小鼠的学习和记忆能力；苏木素-伊红（HE）、尼氏染色法检测脑组织病理损伤；RNA-Seq检测小鼠海马组织差异表达基因，对差异基因进行基因本体（gene ontology,GO）功能和electric bioimpedance京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）通路富集分析，筛选JuA治疗阿尔茨海默病（Alzheimer disease,AD）可能干预的信号通路，并对其中的核心富集基因进行qRT-PCR与Western blotting实验验证。结果 水迷宫实验结果显示，JuA组小鼠的学习记忆能力显著高于模型组（P<0.05、0.01），高剂量组作用CB-839浓度最佳。HE和尼氏染色结果显示，与模型组比较，JuA组小鼠皮层和海马区神经元损伤明显减轻，尼氏体数量明显增多（P<0.01），说明JuA对AD小鼠脑组织有明显保护作用。RNA-Seq分析结果显示，模型组相较于对照组脑中明显上调的基因有218个，下调123个；JuA组相较于模型组明显上调基因有66个，下调28个；模型组中包括葡萄糖激酶（glucokinase,Gck）在内的5个差异基因经JuA干预后表达趋势被逆转。GO分析发现JuA治疗后差异基因主要富集在离子转运调控、细胞骨架、核受体活性等方面。KEGG通路分析发现JuA治疗后主要富集于2型糖尿病、细胞黏附因子、白细胞介素-17(inteNSC 125973说明书rleukin-17,IL-17)信号通路和转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)信号通路；筛选模型组vs对照组、JuA高剂量组vs模型组共同调节的与JuA治疗AD相关性最高的前10条通路，发现主要集中于代谢疾病和炎症通路；Gck基因在这些通路上高频出现，说明其可能是JuA干预AD的重要靶点之一，qRTPCR与Western blotting实验也验证了对Gck基因的筛选分析结果。结论 JuA能明显减轻AD小鼠脑组织病理损伤，提高学习记忆能力，其作用机制可能与调控炎症反应与代谢紊乱有关，其中上调Gck mRNA与蛋白表达维持葡萄糖稳态可能是JuA抗AD的重要机制之一。

经典的免疫系统分为固有免疫和适应性免疫。传统观念认为，免疫记忆仅存在于适应性免疫中，然而，在缺乏适应性免疫的生物体中，先天免疫系统的细胞能够在短暂刺激后获得记忆特征，从而在二次抗原激活后增强有效免疫，这种现象被称为训练免疫。训练免疫可以在肿瘤治疗中发挥独特的作用。卡介苗（BCG）诱导的训练免疫已经成为膀胱癌的标准治疗方法；BCG在黑素瘤中的治疗效果也于近年得到肯定；通过不可逆电穿孔（irreversible electroporation, IRE）提高治疗过程中训练免疫效应可以延LGX818长胰腺癌患者生存期；全β-葡聚糖颗粒（whole β-glucan particle, WGP）诱导的训练免疫可以有效抑制肿瘤肺转移；通过纳米颗粒（nanGenetic databaseoparticles, NPs）引入药物可以提高乳腺癌靶向部位的训练免疫效果。这些研究对改善现有治疗策略、延长患者生存获益更多具有重要意义。本文重点阐述训练免疫的概念、机制以及在肿瘤治疗领域的现状。

目的 观察急性胰腺炎（acutepancreatitis，AP）中是否存在铁死亡以及铁离子对核苷酸结合寡聚化结构域受体蛋白3（NLRP3）途径的影响，探讨保护胰腺腺泡细胞的机制。方法 将45只雄性C57BL/6小鼠随机分为3组[对照组、AP组、AP+2’2-联吡啶组（2’2-bipyridyl）]。50μg/kg的雨蛙素（caerulein）共注射12次，每次间隔1h。AP+2’2-bipyridyl组在注射caerulein之前用2’2hepatic T lymphocytes-Bipyridyl（20mg/kg）预处理1h。对照组则注射等量的正常生理盐水。所有的小鼠在最后一次注射后1h被处死。收获的胰腺用于组织病理学评估、免疫组织化学分析、试剂盒检测和Westernblotting。结果 铁死亡抑制剂2’2-bTrichostatin A核磁ipyridy可以防止铁离子的积累，减少脂质过氧化物的形Pevonedistat成；它还可以通过NLRP3途径减轻胰腺炎症损伤。结论 本实验证实了铁死亡这种细胞死方式在AP中真实存在，同时揭示了抑制铁死亡可以减轻AP时的胰腺炎症损伤。

诱导型防御与组成型Enasidenib MW防御是植物防御害虫的重要方式,植物可以通过启动自身的防御机制来应对害虫的取食危害。前期研究发现球孢白僵菌(Beauveria bassiana)作为昆虫病原真菌,能够在植物体内定殖并激活植物的防御系统。但是,球孢白僵菌诱导植物防御途径对是否会影响害虫的生长发育和繁殖,以及产生影响的潜在机制尚不明确。因此,本研究以球孢白僵菌Bb252、番茄(Solanum lycopersicum)和烟粉虱(Bemisia tabaci)MED隐种为研究系统,探究球孢白僵菌作为一种植物内生真菌诱导的番茄防御反应对害虫的影响及机制。主要研究结果如下:1.球孢白僵菌定殖对番茄苯丙烷类代谢途径及其产物含量的影响球孢白僵菌接种定殖后,通过对番茄苯丙烷类代谢途径基因进行定量检测,发现接种3 d后,番茄苯丙烷类代谢途径基因开始上调表达;在接种7 d后,上调表达的表达倍数与基因数量最多,苯丙氨酸解氨酶基因(PAL)、肉桂酸-4-羟基化酶基因(C4H)、以及黄烷酮3-羟化酶基因(FLS)在所有时间点均上调表达,在接种7 d后PAL基因、查尔酮合成酶基因(CHS)、FLS基因分别上调16.45倍、7.93倍和7.93倍,并达到峰值。这些基因参与苯丙烷类代谢途径产物的代谢途径。在明确球孢白僵菌诱导番茄苯丙烷类代谢途径基因上调表达后,进一步检测苯丙烷类代谢途径产物含量的变化。测定结果表明,番茄的单宁、花青素以及类黄Uyghur medicine酮含量在接种球孢白僵菌3 d、7 d和14 d后均上升。在球孢白僵菌接种7 d时,番茄中花青素、单宁和黄酮的含量达到最高,分别是未接种番茄的2.92倍、2.02倍和2.07倍,证实球孢白僵菌诱导激活番茄苯丙烷类代谢途径并促进番茄次生代谢物的生成。2.苯丙烷类代谢途径产物对烟粉虱生长发育和生殖力的影响为了明确番茄苯丙烷类代谢途径的产物对番茄上主要害虫烟粉虱的影响,本研究配制了含有不同比例植物次生代谢物的人工饲料,饲喂烟粉虱后观察烟粉虱雌虫的生殖力、成虫存活率及后代发育历期。烟粉虱取食含有不同浓度的次生代谢物质的人工饲料后其日均产卵量与总产卵量都有所下降,其中取食3 mg/kg单宁人工饲料、4 mg/kg单宁人工饲料、4.5 mg/g花青素人工饲料和70 mg/g黄酮人工饲料后总产卵量比对照组分别降低了14%、19%、16%和12%。烟粉虱在取食含有不同比例苯丙烷类代谢途径的产物的人工饲料后的成虫存活率均低于对照但无显著性差异。烟粉虱取食植物次生代谢物质后产下的后代较对照组发育历期延长,其中70 mg/g类黄酮与4.5 mg/g花青素处理组中,烟粉虱后代发育历期显著延长至24 d左右。因此,球孢白僵菌定殖后诱导番茄产生的苯丙烷类代谢途径产物对害虫烟粉虱有种群有显著的抑制作用。3.植物次生代谢物质对烟粉虱消化能力及解毒代谢的影响在明确植物防御反应对烟粉虱生长发育的影响基础上,本研究从生理和分子生物学水平上探究了番茄苯丙烷类代谢途径的产物对烟粉虱消化功能以及解毒代谢的影响。烟粉虱在取食含有不同比例植物次生代谢物质的人工饲料后,消化相关基因立即呈现下调表达的趋势。蔗糖酶、淀粉酶、蛋白酶等消化基因持续呈现低表达,随着取食时间的延长下调倍数增多。此外,淀粉酶活性、胰蛋白酶活性以及蔗糖酶活性也呈现下调趋势。结果表明烟粉虱体内消化酶活性受到植物次生代谢物质的抑制,从而可能导致烟粉虱个体营养摄入不足,影响正常生长繁殖。烟粉虱在取食含有不同含量植物次生代谢物质的人工饲料后,解毒酶基因在取食初期呈现上调表达趋势,随着取食时间延长基因上调表达倍数开始降低。烟粉虱体内解毒代谢相关酶活性在烟粉虱取食植物次生代谢物质后均开始上调。结果证明苯丙烷类代谢途径产物能够对烟粉虱形成胁迫,从而激活解毒代谢途径。然而,烟粉虱在长期取食植物次生代谢物质的情况下,随着体内植物次生代谢物质含量增高其解毒代谢基因水平却并未维持高水平表达,解毒代谢能力受到抑制。综上所述,本研究证明了与未接种球孢白僵菌的植株相比,球孢白僵菌定殖的植株能够激活植Trichostatin A化学结构物对害虫的防御作用,破坏昆虫的消化系统以及解毒代谢系统,对害虫种群的生长繁殖造成影响。为利用球孢白僵菌作为外源刺激物质诱导植物对农业害虫的防控提供了理论依据,也为解析真菌-植物-害虫三者的互作关系奠定了基础。

目的 分析枸橼酸钠体外抗凝在床旁血液滤过治疗中的疗效，以及对患者凝血功能的影响。方法 选取2019年4月至2022年4月新余市人民医院收治的76例有活动性出血或出血倾向的患者，采用随机数字表法分为两组，各38例。两组患者均采用床旁血液滤过治疗，参照组患者采用体外低分子肝素抗凝，研究组患者采用体外枸橼酸钠抗凝，比较两组患者治疗前、治疗后4 h外周血钙离子（Ca~(2+)）、HCO_3~-、pH值及凝血酶时间（TT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）、凝血酶原时间（PT）水平，以及出血并发症总发生率。结果 与治疗前比，治疗后4 h研究组患者Ca~(2+)浓度显降低，HCO_3~-浓度Gefitinib-based PROTAC 3细胞培养、pH值升高，且研究组Ca~(2+)浓度低于参照组，HCO_3~-浓度、pH值高于参照组（均P<0.05）；而治疗前后参照组患者Ca~(2+)、HCO_3~-、pH值组内比较，差异无统计学意义（均P>0.05）；与治疗前比，治疗后4 h参照组患者TT、APTT、PT均显著延长，但研究组显著短于参照组（均P<0medical device.05）；而研究组患者组内比较，差异均无统计学意义（均P>0.05）；研究组患者出血并发症总发生率较参照组显著降低（P<0.05）。结论 床旁血液滤过治疗中采用枸橼酸钠体外抗凝，对有活动性出血或出血倾向的患者机体凝血功能影响较小，且可减少出血并发症发生风险，但治疗期间应监测患者Ca~(2diABZI STING agonist纯度+)浓度，根据Ca~(2+)浓度调节枸橼酸钠泵入速度，维持电解质与酸碱平衡。

衰老是机体的生命阶段不可避免的过程,但延缓衰老进程是可能的。随着生活水平不断提高,很多人逐渐开始注重养生并对健康长寿的要求日益提高。天然抗氧化剂有助于机体清除体内多余的自由基,降低毒性物质和外界压力导致的氧化损伤程度,延缓机体衰老。目前,寻找和开发天然易得、高效无毒的抗氧化物质已成为生物医药和食品领域研究的热点和一大挑战。而秀丽隐杆线虫因其结构简单,生命周期短,易于造模等被广泛用于抗氧化物质的筛选和药效研究。现在已经利用秀丽隐杆线虫筛选出大量来源于植物,动物和微生物具有抗氧化和抗衰老活性的物质成分和益生菌。本研究基于秀丽隐杆线虫这一模型,通过体外和体内抗氧化实验进行大量筛选,最终筛选出一株具有一定抗氧化活性的益生菌——海洋动性球菌ML1206和一种红毛棯中提取的挥发油成分E0-2141,并分别对这两种潜在的抗氧化剂在线虫体内的抗氧化和抗衰老作用及可能的作用机制进行探究。本论文取得的主要研究结果如下:(1)明确了海洋动性球菌ML1206在N2线虫体内的抗氧化和抗衰老作用,并初步探究其具体的分子机制。本实验通过寿命实验和环境应激实验,发现ML1206能显著延长线虫的健康寿命和氧化应激下的寿命,并增强了线虫抵抗百草枯和H2O2诱导的急性氧化应激和热应激的能力。此外,ML1206可以显著提高线虫CAT和GSH-PX的活性,并减少线虫在氧化应激条件下体内ROS的积累,这与应激抗性提高的结果相互印selleck HPLC证。同时我们揭示并验证了 ML1206通过促进DAF-16转录因子向细胞核的转移,进而上调其下游抗氧化相关的sod-3、hsp-16.2和ctl-2基因的表达。此外,荧光定量可视化分析实验表明在有或无应激条件下,用ML1206喂养的突变体线虫体内SOD-3::GFP和HSP-16.2::GFP的表达显著高于用OP50喂养的对照组,与qPCR实验结果中sod-3、hsp-16.2的表达增加一致。ML1206显著延长了 daf-2突变体线虫的寿命,没有显著延长daf-16突变体线虫。综上,这些发现表明ML1206是依赖于DAF-16/FOXO提高线虫抗氧化能力并发挥寿命延长效应的。(2)明确了红毛棯挥发油成分E0-2141在N2线虫体内的抗氧化和抗衰老作用,并初步探究其具体的分子机制。本实验检测了红毛棯挥发油的DPPH自由基清除能力,筛选出体外具有一定抗氧化活性的成分E0-2141,并探究其对线虫的抗氧化和抗衰老的影响。结果显示,10 μg/mL和20 μg/mLGSK2118436 molecular weight的E0-2141显著延长了 N2线虫寿命,降低了线虫体内脂褐素积累水平。进一步探究E0-2141对线虫生理指标的影响,发现10 μg/mL和20 μg/mL的E0-2141对线虫运动能力、吞咽能力、体长和生殖能力没有显著影响,这表明低浓度的E0-2141对线虫的生殖能力、生长发育等无明显不良影响。通过分析E0-2141对线虫的食物的清除率影响发现,这种寿命延长不是通过限制线虫饮食的方式来实现的。同时我们发现10 μg/mL和20 μg/mL的E0-2mediator complex141显著提高线虫在氧化应激和热应激条件下的存活能力,显示了 E0-2141具有—定体内抗氧化能力。通过测定线虫体内的抗氧化酶、MDA含量和ROS水平发现20 μg/mL的E0-2141显著提高了线虫SOD,CAT和GSH活性,减少了 MDA含量,进而降低了 ROS水平从而提高线虫抗氧化应激能力。qPCR和DAF-16::GFP可视化实验结果显示,E0-2141对线虫的延寿效应和抗氧化作用是通过抑制akt-1的表达,激活daf-16,提高DAF-16在细胞核中的表达,并上调抗氧化相关基因sod-3,ctl-2和hsp-16.2的表达发挥的。本研究进行了daf-16突变体的寿命实验,得知E0-2141没有延长daf-16突变体的寿命,进一步证实E0-2141对线虫的抗氧化和抗衰老作用依赖于DAF-16。本文的研究成果为开发具有抗氧化活性的微生态制剂和天然的膳食补充剂并用于改善机体健康和干预氧化应激相关疾病提供了一定的理论基础和思路。

魔芋葡甘聚糖(Konjac glucomannan,KGM)具有生物降解性能和优良的成膜性能而被广泛应用于食品包装,但是KGM薄膜易于吸水且机械强度较低,限制了其在食品保鲜上的应用。一般可通过将KGM与天然或合成聚合物混合,或通过对KGM改性,提高KGM薄膜的性能。本研究以KGM为基材,添加黑米膳食纤维(Black Rice Dietary Fiber,BRDF)制备KGM/BRDF复合膜,同时对KGM脱除乙酰基得到脱乙酰魔芋葡甘聚糖(Deacetylated Konjac glucomannan,Da-KGM),再与BRDF共混制备Da-KGM/BRDF复合膜,将改性前后的复合膜应用于蓝莓的保鲜研究。主要研究结果如下:1.K点击此处GM/BRDF复合膜的制备及性能表征。以KGM与BRDF为原料,用蛭石负载牛至精油,在单因素试验的基础上,进行正交试验优化得到KGM/BRDF复合膜的制备工艺,即每100 mL蒸馏水中添加KGM 0.37 g、BRDF 0.074 g、甘油0.60g、蛭石0.074 g,在此条件下KGM/BRDF复合膜的拉伸强度11.15±0.19 MPa、断裂伸长率36±1.3%、溶解度42±1.4%selleck、水蒸气透过系数0.59±0.07g·mm/m~2·h·k Pa、透明度2.7 mm。当牛至精油添加量为12μL/mL时,复合膜溶液能够抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌增殖;红外扫描光谱结果表明复合膜中分子间氢键相互作用增强;扫描电镜结果表明BRDF增加了复合膜的交联度,形成致密的网络结构,横截面的气孔消失。2.Da-KGM/BRDF复合膜的制备及性能表征。对KGM进行脱乙酰基改性,得到Da-KGM,采用流延法与BRDF共混制备Da-KGM/BRDF复合膜。通过响应面优化复合膜制备工艺,即每100 mL蒸馏水中添加脱乙酰度0.2%Da-KGM 0.37 g、BRDF 0.074 g、甘油0.50 g、蛭石0.074 g,在此条件下复合膜的拉伸强度12.67±0.13 MPa,断裂伸长率30±1.7%、溶解度37±1.2%,水蒸气透过系数0.35±0.03g·mm/m~2·h·k Pa。红外扫描光谱结果表明KGM脱乙酰基成功,且复合膜中分子间相互作用增强;扫描电镜结果表明Da-KGM/BRDF复合膜横截面更光滑、更均匀,形成了更致密的网络结构。3.Da-KGM/BRDF复合膜及KGM/BRDF复合膜对蓝莓的保鲜。以PE膜为对照,将Da-KGM/BRDF复合膜、KGM/BRDF复合膜用于蓝莓保鲜,结果表明Da-KGM/BRDF复合膜处理组蓝莓腐烂率及失重率较低,可溶性固形物、维生素Cmediator effect及总酸含量损失较少,霉变、皱缩和软化蓝莓果较少,能保持良好的色泽和低腐烂率,保鲜效果优于KGM/BRDF复合膜。

目的 观察芪术增力方对裸鼠癌因性疲乏的影响，探讨其可能的作用机制。方法 在TCMSP平台搜索芪术增力方活性成分，通过UniprotBMN 673供应商数据库转化为相关靶点；在GeneCards数据库、OMIM数据库、DrugBank数据库搜索癌因性疲乏相关靶点，通过Jvenn平台绘制药物、疾病靶点交集图，String平台制作蛋白质互作网络（protein-proteininteractionnetworks，PPI），Metascape平台制作基因本体（geneontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（kyotoencyclopediaofgenesandgenomes，KEGG）富集分析，选取癌症蛋白聚糖（proteoglycansincancer）信号通路进行研究。将25只裸鼠随机分为空白组、模型组、中药组、化疗组（顺铂）及地塞米松组。构建癌因性疲乏模型，干预3周后，ELISA法检测裸鼠瘤体内磷脂酰肌酶聚糖受体（glypican，GPC）1、磷脂酰肌酶聚糖受体（glypican，GPC）5、多配体蛋白聚糖（syndecan，SDC）2、丝甘蛋白聚糖（serglycingene，SRMRTX1133供应商GN）表达；观察光镜下各组裸鼠瘤体组织的病理形态。结果：与模型组比较，中药组及化疗组的GPC1水平显著降低（P＜0.01）；中药组SDC2水平降medical mycology低（P＜0.05）；中药组、化疗组、地塞米松组瘤体内SRGN水平均降低（P＜0.05）。结论 芪术增力方通过降低裸鼠瘤体内GPC1、SDC2、SRGN水平达到缓解疲乏的效果，其机制可能与抑制肿瘤生长、转移有关。

乳果糖是一种具有强效益生元特性的非消化性二糖,广泛应用于健康食品和临床医药领域。基于生物催化剂合成乳果糖被认为是更绿色、安全且高效的路径。目前,来源于Caldicellulosiruptor saccharolyticus的纤维二糖差向异构酶(Cs CE)被认为是最具应用前景的乳果糖制备酶,但是存在结构异构活性较低、底物亲和力差以及副产物依匹乳糖的积累等制约因素。分子改造是改善酶催化性能的有效策略,本研究致力于探索影响结构异构活性的关键作用区域,通过半理性设计对酶的柔性环及底物结合位点进行改造,增强Cs CE对底物乳糖的结构异构活性及底物亲和力,从而提高乳果糖的转化率;基于酶学研究基础,构建大肠杆菌多酶级联催化细胞工厂,探究其在乳清粉增值研究中的应用,推动生物法制备乳果糖的工业化应用进程。主要研究内容和结论如下:首先,针对Cs CE结构异构活性差、影响酶催化方向的关键作用域不清晰的问题,对具有不同催化方向的N-acyl-D-glucosamine 2-epimerase(AGE)家族酶进行序列及晶体结构对比,发掘影响结构异构及差向异构催化方向的关键区域,并通过分子改造进行验证。根据AGE家族酶的晶体结构比对发现,它们拥有相同的(α/α)_6基本桶状结构,但是位于A、B两处的柔性环的长度和形状存在较大差异,结合AGE家族酶的底物特异性及催化机制等信息进一步提出了“柔性环所处的位置(A或B)及形状影响其催化方向”的猜想。为验证GW-572016 molecular weight该猜想,以Cs CE和来源于Marinomonas mediterranead的甘露糖结构异构酶(Mm MI)为改造模板,选取A/B柔性环形状差异较大的位置进MCC950配制行替换,成功构建了Cs-AS、Cs-AS+BL、Cs-BL、Cs-AP、Mm-BS、Mm-BS+AL和Mm-AL共7个突变体,并探究了突变体的催化方向。结果表明,具有双催化方向的Cs CE的A柔性环显著影响其结构异构活性,而对差向异构活性影响较小;具有单催化方向的Mm MI的B柔性环的存在与否直接影响其结构异构催化活性。由此可以得出结论,AGE家族酶的柔性环所处位置、长度及形状与酶的催化方向密切相关。基于上述发现,探究了A柔性环改造对Cs CE催化活性的影响。通过柔性环交换的方法将Cs CE柔性环中靠近底物非还原端的部分(“下端”)替换成来源于Bacillus thermoamylovorans(Bt CE)、Rhodothermus marinus(Rm CE)、Ruminococcus albus(Ra CE)和Spirochaeta thermophila(St CE)的CE柔性环的相应区段,分别构建了四个基于Cs CE的柔性环突变体:Bt C、Rm C、Ra C和St C。相较于野生型Cs CE,重组酶Rm C的结构异构活性增加了2.2倍,且催化效率增加了1.34倍。分子动力学模拟结果表明,Rm C柔性环更加远离活性中心,具有更大的底物入口,有利于底物进入和稳定酶-底物构象。以上结果证实活性中心入口处的A柔性环的形状和组成是影响酶催化活性的关键因素,可以通过影响底物结合和质子转移来调控酶的催化活性。Cs CE对于底物乳糖的亲和力较差(K_m,417.5 m M)导致酶催化效率低。鉴于柔性环改造可以促进酶与底物非还原端之间的相互作用,进一步推测底物非还原端的结合作用可能直接影响酶的底物亲和力,采用半理性设计策略对Cs CE底物结合位点进行了重塑。由酶-配体复合物的晶体结构得知Cs CE/W308和Cs CE/W372分别位于底物的还原端和非还原端的吡喃环侧MEM modified Eagle’s medium,其中Cs CE/W308在整个AGE家族酶序列中保守,而Cs CE/W372仅在CE酶序列中保守。通过对Cs CE/W372位点的饱和突变证实了该残基负责识别二糖非还原端并形成π-π相互作用,有助于底物的稳定性和正确构象。进而将底物结合区域划分为三个亚区:区域A,与底物还原端相互作用的底物结合亚区(包括残基I306和W307);区域B,与底物的非还原端相互作用的底物结合亚区(残基Q371);区域C,活性中心入口亚区(残基W355)。通过对底物结合位点的饱和突变获得了结构异构活性增强3.3倍、催化效率提高1.53倍且底物亲和力显著改善的突变体Cs CE/Q371E(K_m值由417.5 m M降低至269.65 m M),同时乳果糖的转化率由60%提升至72%。分子动力学模拟发现,Cs CE/Q371E活性中心具有丰富的氢键网络使底物构象更加稳定;催化残基His188和底物之间相互作用力的增强有助于提高结构异构化方活性;此外,Q371E的突变改变了催化残基His377和C2/O1原子之间距离,促使催化向结构异构化方向进行。以上研究表明底物结合位点的重塑可显著改善酶与底物的亲和力,最终提高乳果糖产量。由于单酶催化体系存在副产物依匹乳糖、酶纯化成本高、需要高温反应(75℃)等缺陷,通过构建双酶级联催化细胞工厂解除限制,并将其进一步应用于乳清粉生物催化制备乳果糖的研究中。首先,在CE催化体系中引入具有将依匹乳糖转化成乳果糖的结构异构酶(MI),构建CE-MI双酶级联体系,级联体系促进了副产物依匹乳糖的转化,将乳果糖产量由3.55 g/L提高至4.0 g/L;针对CE与MI分别进行分子改良,成功获得乳果糖产量提高43%的Mm MI突变体(F242N);将优化升级后的催化模块Cs CE/Q371E与Mm MI/F242N构建于p ET28b质粒载体上,并通过RBS策略调节两酶表达量,最终获得了乳果糖最高产量的共表达菌株:E.coli p ET28b-_(T7)-_(RBSW)-Cs CE/Q371E-_(T7)-_(RBS29)-Mm MI/F242N。将该细胞工厂应用于乳清粉的增值利用研究中,乳果糖转化率达到91.3%,且副产物依匹乳糖产量下降至3.5%,显著优于单酶发酵体系(乳果糖,63%;依匹乳糖,12%)。上述研究结果表明,构建的大肠杆菌双酶级联细胞工厂能够促进副产物依匹乳糖转化成目标产物乳果糖,且无需酶的分离纯化,在制备高产量及高纯度乳果糖方面具有良好的应用潜力。