糖尿病是一种慢性代谢性疾病,近年来发病率持续上升且具有年轻化趋势。苦荞具有潜在的代谢性疾病预防功能。苦荞中的淀粉与黄酮可以相互作用结合形成苦荞淀粉黄酮复合物(BSF),一方面抑制苦荞淀粉消化从而降低了升糖指数,另一方面提高Medication non-adherence了苦荞黄酮的生物利用度和稳定性,这些特点使苦荞成为一种良好的降糖食品。在前期苦荞淀粉黄酮复合体系体外化学实验结果基础上,本研究通过计算机分子模拟及动物实验对苦荞功能因子-靶点-疾病之间的关系进行深入探讨,阐明苦荞降血糖机理,主要研究结果如下:1.苦荞中活性最高的黄酮单体为芦丁与槲皮素,其与苦荞淀粉主要通过氢键作用力形成苦荞淀粉黄酮复合物。苦荞黄酮(芦丁、槲皮素)均可以稳定进入淀粉消化酶(α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶)活性口袋,槲皮素与两种淀粉消化酶的结合作用强于芦丁,苦荞黄酮与α-葡萄糖苷酶的结合作用强于α-淀粉酶。芦丁与槲皮素对GK蛋白、GSK-3β、DPPⅣ通路关键蛋白均有较好的抑制作用,特别是GSK-3β受体蛋白,抑制常数极小,芦丁与槲皮素分别为11.43 n M和11.99 n M。2.BSF显著改善糖尿病小鼠“三多一少”症状,MIX对体重下降的改善作用较BSF具有显著性差异,但两者对于摄食量与饮水量改善作用无明显差异。BSF对糖尿病小鼠肝脏肥大、肾脏萎缩、胰岛萎缩具有较好的改善作用,对于空腹血糖及葡萄糖耐量水平与二甲双胍无显著性差异。MIX与BSF在糖尿病小鼠脂质代谢紊乱的调节作用较一致无显著性差异,并且呈剂量依赖性关系。BSF在氧化应激水平上与MIX存在非常显著差异;HD-BSF较糖尿病小鼠血浆TNF-α、IL-6水平分别下降了38.97%、51.53%。3.BSF可以减轻糖尿病导致的高胰岛素血症,对于胰岛素抵抗、胰岛素PR-171说明书敏感性及胰岛β细胞功能具有明显改善作用;C-P水平与胰岛素清除率结果发现BSF干预较好改善糖尿病小鼠胰岛素β细胞功能,提高肝脏的胰岛素降解能力。PC组对肝脏炎症改善效果最佳,低剂量BSF与MIX对糖尿病小鼠肝脏炎症没有明显改善作用,但高剂量BSF具有改善效果。PC组可以促进肝糖原合成,降低肝糖原分解速率,以达到改善胰岛素抵抗的作用,苦荞干预组中HD-BSF效果最佳。H&E染色结果与肝脏炎症指标一致,HD-BSF组细胞核状态已恢复至与正常小鼠相似状态,细胞内红染面积增加,细胞分布均匀,因此可判断糖尿病小鼠肝脏损伤的改善作用较明显,而MIX与LD-BSF组脂质浸润及炎症状态无明显改善作用。4.SCFAs结果发现高剂量BSF可以提高所有SCFAs含量,总酸HD-BSF较糖尿病小鼠提升了327%,经过复合处理的BSF对SCFAs的改善作用明显优于等量的混合物。通过Pan/Core物种分析及Rank-Abund3-MA试剂ance曲线可以发现本实验6组测序深度合理。Alpha多样性结果发现高剂量BSF与二甲双胍可以提高糖尿病小鼠菌群丰度及多样性;Beta多样性发现糖尿病小鼠肠道菌群组成与正常小鼠有显著性7-8,高剂量BSF与MIX组小鼠对糖尿病小鼠肠道菌群的改善作用较强,二甲双胍干预后个体差异性较大,且改善作用未达到前两组水平。门水平角度BSF对肠道菌群紊乱调节作用优于MIX。HD-BSF与MIX对糖尿病小鼠干预效果明显优于二甲双胍;属水平上HD-BSF对糖尿病小鼠肠道有益菌属提升作用较明显,MIX组与HD-BSF组在双歧杆菌属、粪杆菌属丰度上无显著性差异,在乳酸菌属丰度上存在显著性差异,PC组与LD-BSF组的改善作用较弱且无显著性差异。以上结果发现,苦荞淀粉与黄酮可以形成稳定的苦荞淀粉黄酮复合物,且苦荞黄酮可以稳定进入淀粉消化酶的活性口袋,以抑制淀粉消化酶活性,达到提高淀粉抗消化性的目的。BSF在糖尿病小鼠生理生化指标具有较好的改善作用,特别是血糖、胰岛素及氧化应激、胰岛相关指标,但对于脂质代谢及肝脏炎症状态调节作用相对较弱。此外,与二甲双胍相比BSF对肠道菌群紊乱的调节作用个体差异性更小且状态更接近正常小鼠,BSF较MIX显著提高糖尿病小鼠粪便中SCFAs含量。综上,BSF具有明显降糖效果,对糖尿病及肠道菌群紊乱有明显改善作用。
Author: admin
褪黑素对草莓果实贮藏品质及其调控基因差异表达的影响
本文以‘红颜’和‘章姬’草莓品种为试验材料,研究了外源褪黑素对草莓采后贮藏期间各生理生化指标以及香气物质的影响,探讨了褪黑素对草莓果实的保鲜效果,筛选出最佳处理浓度,同时解析了确认细节外源褪黑素调控草莓差异基因的表达变化,旨在为褪黑素在草莓果实采后贮藏保鲜上的应用研究提供理论参考。研究结果如下:(1)外源褪黑素处理可降低果实腐烂率和腐烂指数,维持较高的可溶性固形物含量,提高维生素C含量和可滴定酸含量(TA),促进总酚、类黄酮、花青素等酚类物质的合成,抑制丙二醛(MDA)积累,提高果实中SOD、POD酶活性和DPPH自由基清除能力。综合分析,‘红颜’和‘章姬’分别以500μmol·L~(-1)、700μmol·L~(-1)褪黑素处理效果最佳。(2)外源褪黑素增加了草莓果实香气物质的种类与组分。随处理时间延长,香气物质总体上呈先增加后降低的趋势,贮藏第4 d时,草莓果实主要香气物质种类最多,其顺序为:脂类物质>醇类物质>醛类物质>酮类物质,香气组分以乙酸乙酯和乙酸甲酯含量较高。综合分析,‘红颜’和‘章姬’分别以500μmol·L~(-1)、700μmol·L~(-1)褪黑素处理在贮藏第4 d时香气品质效果最佳。(3)利用转录组测序技术对CCRG 81045褪黑素处理的‘红颜’果实差异基因表达进行分析,确定了1807个差异表达基因,64个功能组,其中上调基因有860个,下调基因有947个。差异表达基因主要涉及代谢过程、细胞过程、生物调控过程、生物过程、细胞部分、氧化还原过程、氧化还原活性过程等。筛选出9个蔗糖合成酶关键基因,14个酸类合成酶关键基因,FvH4_4g08100、FvH4_6g02860、FvH4_6g347Virologic Failure10等17个可能是参与调控草莓果实采后代谢的转录因子。
分析不同手术切口对青光眼白内障联合手术患者角膜内皮的影响
目的 评价青光眼白内障联合手术患者采用不同手术切口治疗对于glandular microbiome角膜内皮产生的影响。方法 选取2021年6月—2022年6月临沂市人民医院收治的72例行小梁切除联合超声乳化术的青光眼合并白内E7080体内实验剂量障患者为研究对象,根据随机数表法分为对照组和观察组,每组36例,对照组采用双切口治疗,观察组采用单切口治疗,对比两组患者的疗效。结果 观察组术后不同观察阶段的角膜内皮细胞计数高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。观察组术后1年的膜内皮细胞密度(1 655.62±287.87)个/mm~2、膜内皮细胞面积(598.38±7Liproxstatin-1试剂2.37)μm~2高于对照组(1 402.72±287.82)个/mm~2、(536.56±70.98)μm~2,差异有统计学意义(t=3.727、3.659,P<0.001)。结论 青光眼白内障患者采用小梁切除联合超声乳化手术治疗中,采用单切口治疗的效果更佳,有利于降低对角膜内皮的损伤。
蒺藜苜蓿生物钟基因MtTOC1a的克隆及功能验证
【目的】分析蒺藜苜蓿Medicago truncatula生物钟基因MtTOC1a的蛋白结构,探究MtTOC1a在生物钟系统中的生物学功能,比较其与拟南芥Arabidopsis thaliana的AtTOC1功能相似性和差异性。【方法】通过生物信息学分析,在全基因组范围内鉴定了TOC1在蒺藜苜蓿中的同源基因。构建MtTOC1此网站a基因的表达载体,利用农杆菌介导法引入到拟南芥野生型Col、及相应的功能丧失突变体toc1-2中,进行遗传互补分析。【结果】Mt TOC1a和MtTOC1b均具有保守的功能结构域和三维结构。遗传分析表明,在早期光形态建成中,外源转化的MtTOC1a完全恢复了toc1-2的下胚轴伸长表型,但对toc1-2的提前开花表型没有显著影响。在引入CAB::LUC报matrilysin nanobiosensors告基因的株系中,外源转化MtTOC1a在连续光照下使短周期突变体toc1-2的近日节律周期延长,但仍不能完全恢复至野生型水平。【结论】MtTOC1a和拟南芥AtTOC1的功能存在相似性,但在不同的下游调控途径中所扮演的角色存在差异。本研究结果为进一步探索MtTselleckchem GDC-0068OC1a基因的功能,利用MtTOC1a基因改造苜蓿的重要性状提供了理论依据。
口服低剂量甲氨蝶呤致化疗性口腔黏膜炎1例及文献回顾
目的 探讨低剂量甲氨蝶呤导致化疗性口腔黏膜炎的诊治,为临床提供参考。方法 报道银屑病患者短期应reduce medicinal waste用低剂量甲氨蝶呤(1周内最高累积用药量为15 mg)导致重度化疗性口腔黏膜炎1例,并结合文献进行回顾性分析。结果 该病例因低剂量应selleck激酶抑制剂用甲氨蝶呤(第1、2、4周,隔天1次,每次口服2.5 mg;第3周,连续3天,每次2.5 mg,共2次,1周内最高累积用药量为15 mg)治疗银屑病,约在第3周不规律用药后,患者逐渐出现重度口唇糜烂、疼痛、进食困难以及双腿皮肤糜烂;入院后停用甲氨蝶呤,给予康复新液等局部对症治疗,合并中性粒细胞减少时全身应用重组人粒细胞集落刺激因子。治疗后,患者化疗性口腔黏膜炎和皮肤损害得到改善。文献回顾表明,化疗性口腔黏膜炎是高剂量应用甲氨蝶呤后的毒性反应,而低剂量应用甲氨蝶呤导致重度化疗性口腔黏膜炎的病例较为少见。研究发现,患者合并的危险因素越多,如口腔局部状况差以及患者合并肝肾功能障碍、糖尿病等全身系统性疾病时,发生化疗性口腔黏膜炎的危险程度越高。临床医师在应用化疗药物前要尽可能联合口腔医师处理相关口腔疾病;患者服用甲氨蝶呤时,应注意患者的全身状况及易感因素,规范给药频次和剂量,采取个性化治疗方案,同时给予患者详细的用药指导,防止用药错误导致不良后果的发生。若出现甲氨蝶呤中毒,应及时停药、解毒,给予积极对症支持治疗。口腔基础护理、冷冻疗法、激光疗法、营养支持、止痛药物等是化疗性口腔黏膜炎常用的治疗方法;当伴有中性粒细胞减少时Roxadustat可以考虑全身应用粒细胞集落刺激因子。结论 临床上需警惕低剂量甲氨蝶呤导致重度化疗性口腔黏膜炎的发生。
医联体背景下专科护士主导的肿瘤护理专科联盟病房的构建与实施
目的 探索医联体背景下以专科护士为主导构建肿瘤护理专科联盟病房的实践效果。方法 分析医联体病房的发展现状,依托区域协同优势,通过组建专科联盟小组、规范专科联盟病房规章制度、实施以专科护士为主导的临床护理帮扶,并进行护理质量监控,带动护理同质化,对专科联盟病房完成工作量、护士专科护理能力、护理质量及患者满意度进行效果评价。结果 以专科护士为主导的肿瘤护理专科联盟病房构建后科室收治患者数及专科数据均提高,护士专科理论和操作考核成绩较构建前明显提高(P<0.01);化疗药物经中心静脉输注率、化疗药物输注正确率、营养风险评估正确率均较构建前提高(P<0.01);化疗药物外渗发生率Immune-to-brain communication较构建前降低(P<0.05),患者满意度提高。结论 医联体背景下以专科护士为主导的肿瘤护理专科联盟病房的构建,能促进基层医院的科室建设、提升护士专科护理能力、提高护理质量和患者满意度,从而保证专科服务质量,保证患者治疗安全,更多充分体现了医疗护理资源共享、优质护理资源Alisertib纯度向基层辐射的优势,是对分级诊疗的有益探索。
西藏地区MDT下中晚期HCC患者HAIC与TACE的疗效与安全性对比
目的:比较在多学科协作团队(multidisciplinarMRTX849说明书y team,MDT)模式下肝动脉灌注化疗(HAIC)与经动脉化疗栓塞(TACEMRTX1133半抑制浓度)治疗晚期肝细胞癌(HCC)的疗效和安全性。采用HAIC组和TACE组联合抗PD-1免疫治疗和TKIS治疗的CNLCⅡb~Ⅲb中晚期HCC患者,通过比较HAIC联合组与TACE联合组的临床病理特点、无进展生存期(progress free survival,PFS)、总生存期(overall survival,OS)、疗效及不良事件(AES),并对影响治疗效果及生存期的相关因素进行分析,为西藏地区肝癌三联模式数据的规范化诊治提供参考,提高患者生活质量,延长其生存期。方法:通过检索自2018年1月至2022年12月收治的CNLCⅡb~Ⅲb期且符合纳入标准的肝癌患者76例,其中HAIC联合组34例,TACE联合组42例,经MDT讨论及评估后,两组都予以联合TKIS和抗PD-1免疫治疗。通过腹部增强CT或MRI了解治疗效果,每4-8周为一个疗效评价周期,最终依据实体肿瘤的疗效评价标准1.1版本(response evaluation criteria in solid tumors version 1.1,RECIST1.1)进行疗效评估。通过随访了解两组患者生存情况,绘制生存曲线、分析影响因素、观察两组的毒副作用,评判两种治疗方案孰优孰差。结果:1.HAIC联合组和TACE联合组的m OS(中位总生存期)分别为22.5个月和11.0个月(HR=0.3322,95%CI:0.1903~0.5798,P=0.0001),两组的m PFS(中位无进展生存期)分别为13.0个月和5.0个月(HR=0.3160,95%CI:0.1406~0.6861,P=0.0038),差异具有明显的统计学意义(P<0.05)。HAIC联合组的PR、SD和PD的占比分别为:2.9%、70.6%和26.5%;而TACE联合组的PR、SD和PD的占比分别为:2.4%、40.5%和57.1%,DCR(73.5%vs 42.9%,P=0.007),两组具有显著差异(P<0.05)。3.两组PFS的影响因素亚组分析:在HAIC联合组和TACE联合组的PFS亚组分析表中可知,ALBI grade3、肿瘤直径Nucleic Acid Purification≤7cm、NLR≤3(中性粒细胞/淋巴细胞)对患者的无进展生存期的影响起着至关重要的作用,这些影响因素在亚组方面的差异具有统计学意义(P<0.05)4.两组OS的影响因素亚组分析:在HAIC联合组和TACE联合组的OS亚组分析表中可知,ALBI grade 2-3、肿瘤直径≤7cm、NLR≤3(中性粒细胞/淋巴细胞)对患者的总生存期的影响起着至关重要的作用,这些影响因素在亚组方面的差异具有统计学意义(P<0.05)5.两组最常见的3级/4级治疗相关不良事件为腹痛(9[26.5%]VS 19[45.2%])和肝功能障碍(8[23.5%]VS 35[83.3%]),余皆无明显差异,但所有AES患者均可耐受,无治疗相关性死亡事件发生。结论1.HAIC联合组较TACE联合组抗肿瘤活性更强,明显改善了西藏地区CNLCIIb-IIIb期肝癌患者的SD、DCR等近期疗效并提高了肝癌患者的PFS、OS。2.在HAIC联合组和TACE联合组的PFS亚组分析表中可知,ALBI grade3、肿瘤直径≤7cm、NLR≤3(中性粒细胞/淋巴细胞)对患者的无进展生存期的影响起着至关重要的作用;在HAIC联合组和TACE联合组的OS亚组分析表中可知,ALBI grade 2-3、肿瘤直径≤7cm、NLR≤3(中性粒细胞/淋巴细胞)对患者的总生存期的影响起着至关重要的作用。3.HAIC三联方案是治疗不能切除的HCC的一种安全有效的方案,这种联合治疗比TACE为主的联合治疗在疗效、生存期及安全性方面更佳。
剪切波弹性成像对灰区前列腺癌的诊断价值研究
目的 探讨剪切波弹性成像(SWE)检测血清总前列腺特异度抗原(t-PSA)位于灰区前列腺癌(PCa)的价值。方法 收集t-PSA位于灰区的患者83例,于穿刺活检前用SWE测量前列腺的整体硬度,包括最大杨氏模量(Emax)、平均杨氏模量(Emean)及最小杨氏模量(Emin)。分析前列腺整体硬度及前列腺特异度抗原密度(PSAD)与前列腺穿刺活检病理结果之间的相关性。结果 83例患者中,PCa 22例,前列腺增生(BPH)61例。PCa组的整体硬度Emax、Emean及PSAD均大于BPH组(P<0.05),而两组间的Emin无统计学意义(P>0.05)。Emax、Emean及PSAD诊断PCa的最佳截断值分别为113.2 kPa、60.34 kPa及0.16 ng/mL·cm~3,其AMG510说明书曲线下面积(AUC)分别为0.800、0.792与0.824(P>0.05);三者联合后其AUC为0.912,大于各指标单独应用的AUC(P<0.05Optical biosensor)。结论 SWE测量的前列腺整体硬度Emax及Emean对灰区PCa有一ICI 46474抑制剂定的诊断价值,联合PSAD后可使其诊断效能进一步提高。
雷火灸联合穴位贴敷在良性前列腺增生伴夜尿频多患者中的临床效果
目的 探讨良性前列腺增生(BPH)伴夜尿频多患者应用雷火灸联合穴位贴敷的临床效果。方法 采用随机数字表法将2020年12月至2022年12月九江市中医医院收治的68例BPH伴夜尿频多患者分为对照组与观察组,每组各34例。对照组采用常规护理与药物治疗,观察组加用雷火灸联合穴位贴敷,两组均连续干预4周。比较两组的排尿尿线、夜尿次数MRTX849核磁、尿动力学指标、症状严重程度和生活质量。结果 两组干预前的排尿尿线评分、夜尿次数、残余尿量(PVR)、最大尿流率(Q_(max))及国际前列腺症状评分(IZD1839纯度-PSS)、生活质量评分(QOL)Transplant kidney biopsy比较,差异无统计学意义(P>0.05);观察组干预后的排尿尿线评分、夜尿次数、PVR及I-PSS、QOL评分低于对照组,Q_(max)高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 BPH伴夜尿频多患者应用雷火灸联合穴位贴敷能够减少夜尿次数,改善排尿障碍,提高患者生活质量,是一种安全、有效的干预手段,可为今后BPH伴夜尿频多的防治提供参考。
SENP5促进同源重组修复在直肠癌放疗抵抗中的作用及机制
一、研究背景结直肠癌是第三大常见恶性肿瘤,也是肿瘤相关死亡的第二大原因。新辅助放疗联合手术的治疗策略已成为直肠癌患者(Ⅱ/Ⅲ期)的常规治疗方法,术前放疗可以有效缩小肿瘤体积,增加保肛门率,从而有效改善患者的预后。然而,在临床实践中,仍有部分直肠癌患者对放疗不敏感甚至抵抗,肿瘤细胞的放射抵抗是制约疗效的主要障碍。阐明肿瘤细胞放射敏感性的分子机制已成为放射肿瘤学领域面临的主要挑战,对此进行深入研究对于提高放射治疗效果具有重要的指导意义。前期我们课题组利用CRISPR Cas9全基因组文库筛选放疗增敏靶点,结合生物信息学分析和高内涵技术,筛选出对结直肠癌细胞放射敏感性有显著影响的分子SUMO特异性蛋白酶5(SUMO specific peptidase 5,SENP5)。SENP5是SENP特异性蛋白酶家族中的一员,主要通过介导蛋白的去SUMO修饰参与细胞周期、细胞自噬和凋亡等多种生物学过程。SENP5表达失调可能导致细胞功能障碍并诱发癌症。已有多项基于临床肿瘤样本的研究报道,SENP5在肝癌、鼻咽癌和卵巢癌等肿瘤中高表达,且高表达SENP5的患者预后不良。然而,关于SENP5在肿瘤放射敏感性的研究较少,其介导的去SUMO修饰是否参与以及如何调控肿瘤放射敏感性尚不明确。因此,本研究致力于探究SENP5在结直肠癌放射抵抗中的作用及其潜在机制。二、研究内容及方法(一)敲低SENP5对结直肠癌细胞放射敏感性的影响使用实时荧光定量逆转录PCR(Quantitative Real-time PCR,q PCR)和蛋白免疫印迹(Western blot)实验方法检测正常肠道上皮细胞和结直肠癌细胞中SENP5 mRNA和蛋白表达水平。通过免疫荧光和Western blot实验,检测照后SENP5在结直肠癌细胞的亚细胞定位和蛋白表达变化。我们在HCT116和HT29细胞中构建了SENP5敲低结直肠癌细胞系,以探究SENP5在肿瘤放射抵抗中的作用。通过CCK8、克隆形成实验、细胞凋亡和周期实验对比SENP5敲低组和对照组的细胞放射敏感性。(二)SENP5在DNA损伤修复中的作用转录组测序分析照射后对照组和SENP5敲低组细胞mRNA变化,发现DNA复制和损伤修复相关的基因表达下调。利用彗星电泳和γ-H2AX免疫荧光染色检测SENP5敲低细胞的DNA损伤情况。同源重组(Homologous recombination,HR)修复和非同源末端连接(Non-homologous end-joining,NHEJ)修复报告系统用于测定SENP5敲低细胞中HR和NHEJ的修复效率。通过免疫荧光和Western blot实验,我们进一步检测DNA损伤修复通路关键蛋白表达变化。在体内实验中,我们利用结直肠癌细胞系移植瘤模型(Cell derived xenograft,CDX)探究SENP5对体内肿瘤组织放射敏感性的调控作用。最后,我们在SENP5敲低细胞中过表达野生型和去SUMO修饰功能缺失型SENP5开展挽救实验,通过CCK8、克隆形成实验、彗星电泳以及Western blot实验,评估SENP5的去SUMO修饰功能在DNA损伤修复中的作用。(三)SENP5调控DNA损伤修复的靶分子鉴定及功能研究通过SUMO蛋白组学联合SENP5免疫共沉淀质谱分析,初步锁定SENP5调控的靶蛋白H2A.Z。在H2A.Z敲低的细胞中过表达野生型SENP5,通过克隆形成实验检测肿瘤放射敏感性。随后,在HCT116和HT29细胞中,利用H2A.Z抗体进行免疫共沉淀实验检测H2A.Z与SENP5的相互作用。在293T细胞中,通过外源性免疫共沉淀实验检测二者的相互作用。此外,通过H2A.Z免疫沉淀实验检测照射后对照和敲低SENP5细胞中SUMO修饰变化。紧接着,通过染色质免疫共沉淀实验测序(Chromatin Immunoprecipitation sequencing,ChIP-seq)探究敲低SENP5对H2A.Z介导基因转录调控的影响。将H2A.ZGenetic circuits ChIP-seq数据联合转录组测序数据分析,探究SENP5下调对HR修复通路的影响。最后,利用q PCR、WErdafitinib核磁estern blot和免疫荧光实验,探究照射后SENP5敲低细胞中HR修复关键蛋白在DNA损伤修复应答情况。(四)SENP5在直肠癌患者放疗抵抗中的作用及相关性研究通过对直肠癌患者的肿瘤组织芯片进行SENP5免疫组化检测,并结合肿瘤退缩分级评分,我们探究SENP5与直肠癌放射敏感性的相关性。根据SENP5的表达程度将患者分为高表达组和低表达组,并根据临床随访资料绘制患者的生存曲线。为了进一步探究下调SENP5对直肠癌肿瘤组织放射敏感性的调控作用,我们构建患者来源的肿瘤移植瘤模型(Patient derived xenografts,PDX),监测小鼠体重和瘤体体积,对瘤体进行γ-H2AX免疫组化染色。深入了解SENP5在调控直肠癌放射敏感性的作用。三、研究结果(一)敲低SENP5可以增加结直肠癌细胞放射敏感性相对于正常肠道上皮细胞,结直肠癌细胞中SENP5的蛋白和mRNA表达水平均显著升高。因此,我们选择了SENP5高表达的结直肠癌细胞株(HCT116和HT29)进行后续的实验研究。照射后,我们观察到SENP5在细胞中表达量升高,并定位于细胞核。相比于对照组细胞,SENP5下调的结直肠癌细胞照射后增殖能力显著抑制,克隆形成率明显降低。流式分析结果表明,SENP5敲低细胞照射后G2/M周期阻滞减轻,细胞凋亡率增加。(二)SENP5通过其去SUMO功能域促进HR修复而增强辐射抵抗彗星电泳实验提示敲低SENP5加重照射后细胞DNA损伤程度,γ-H2AX免疫荧光染色表明SENP5敲低细胞的DNA损伤修复能力减弱。HR/NHEJ报告系统提示SENP5下调对NHEJ修复没有明显影响,但可以显著抑制HR修复。进一步免疫荧光实验发现,SENP5敲低细胞中HR修复关键蛋白RAD51 foci明显减少,而NHEJ修复关键蛋白53BP1 foci没有显著变化。Western blot实验也发现,SENP5敲低细胞中HR修复关键蛋白ATR、CHK1和CHK2的磷酸化程度降低。同样,在结直肠癌CDX模型中,敲低SENP5的移植瘤生长速度显著降低,且对照射更敏感。免疫组化结果也显示,照射后SENP5敲低结直肠癌移植瘤的HR修复受到显著抑制。最后,在SENP5敲低细胞中的挽救实验表明,过表达野生型SENP5可以减轻照射引起的增殖抑制并促进HR修复。然而,过表达去SUMO修饰功能缺失型SENP5则无此效果。(三)SENP5通过H2A.Z去SUMO化促进HR修复关键蛋白转录调控SUMO修饰蛋白组学联合SENP5蛋白质谱筛选出SENP5作用靶蛋白H2A.Z,并鉴定出其SUMO修饰位点(K121/K122/K126)。H2A.Z敲低细胞中进行SENP5功能挽救实验表明H2A.Z是SENP5促进放射抵抗的主要效应蛋白。随后,内源性和外源性免疫共沉淀实验表明照射后SENP5与H2A.Z结合。然而,位点突变型H2A.Z(H2A.Z-K121R/K122R/K126R)不与SENP5相互作用。H2A.Z免疫沉淀实验表明,照射后SENP5敲低细胞中SUMO修饰水平增加。紧接着,H2A.Z ChIP实验发现与对照组细胞相比,照射后SENP5敲低细胞中H2A.Z与HR修复基因TOPBP1、BRCA2和BARD1启动子结合增加。在照射后的SENP5敲低细胞中,TOPBP1、BRCA2和BARD1的mRNA和蛋白表达水平降低,细胞核内foci数量减少。(四)SENP5可以作为临床放疗标志物和潜在治疗靶点临床直肠癌患者组织芯片结果表明,对于肿瘤组织高表达SENP5的患者,放疗抵抗程度更高,且预后较差。在PDX模型中,敲低SENP5可以明显抑制移植瘤的生长速度。免疫组化染色显示,敲低SENP5可以加剧肿瘤细胞DNA损伤,抑制肿瘤组织增殖。四、研究结论综上,本研究表明SENP5是结直肠癌细胞放射抵抗的关键分子。在体内和体外实验中发现,敲低SENP5可以抑制HR修复,加重INCB018424照射后肿瘤细胞DNA损伤。通过挽救实验,发现SENP5介导的去SUMO修饰在放疗抵抗中发挥重要作用。此外,我们发现SENP5通过调节H2A.Z的去SUMO修饰促进肿瘤细胞放疗抵抗。在SENP5敲低细胞中,H2A.Z与HR修复关键基因TOPBP1、BRCA2和BARD1启动子的结合增加,导致这些分子的mRNA和蛋白表达水平降低,在DNA损伤位点的募集减少,从而抑制HR修复。临床组织芯片数据表明,SENP5表达与患者预后呈负相关。直肠癌PDX模型也进一步验证敲低SENP5可以增加肿瘤的放射敏感性。这些研究揭示了SENP5在DNA损伤反应中的分子机制,为开发潜在的结直肠癌放疗生物标志物和治疗靶点提供新的理论依据。