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目的 探讨良性前列腺增生（BPH）伴夜尿频多患者应用雷火灸联合穴位贴敷的临床效果。方法 采用随机数字表法将2020年12月至2022年12月九江市中医医院收治的68例BPH伴夜尿频多患者分为对照组与观察组，每组各34例。对照组采用常规护理与药物治疗，观察组加用雷火灸联合穴位贴敷，两组均连续干预4周。比较两组的排尿尿线、夜尿次数MRTX849核磁、尿动力学指标、症状严重程度和生活质量。结果 两组干预前的排尿尿线评分、夜尿次数、残余尿量（PVR）、最大尿流率（Q_(max)）及国际前列腺症状评分（IZD1839纯度-PSS）、生活质量评分（QOL）Transplant kidney biopsy比较，差异无统计学意义（P>0.05）；观察组干预后的排尿尿线评分、夜尿次数、PVR及I-PSS、QOL评分低于对照组，Q_(max)高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。结论 BPH伴夜尿频多患者应用雷火灸联合穴位贴敷能够减少夜尿次数，改善排尿障碍，提高患者生活质量，是一种安全、有效的干预手段，可为今后BPH伴夜尿频多的防治提供参考。

一、研究背景结直肠癌是第三大常见恶性肿瘤,也是肿瘤相关死亡的第二大原因。新辅助放疗联合手术的治疗策略已成为直肠癌患者(Ⅱ/Ⅲ期)的常规治疗方法,术前放疗可以有效缩小肿瘤体积,增加保肛门率,从而有效改善患者的预后。然而,在临床实践中,仍有部分直肠癌患者对放疗不敏感甚至抵抗,肿瘤细胞的放射抵抗是制约疗效的主要障碍。阐明肿瘤细胞放射敏感性的分子机制已成为放射肿瘤学领域面临的主要挑战,对此进行深入研究对于提高放射治疗效果具有重要的指导意义。前期我们课题组利用CRISPR Cas9全基因组文库筛选放疗增敏靶点,结合生物信息学分析和高内涵技术,筛选出对结直肠癌细胞放射敏感性有显著影响的分子SUMO特异性蛋白酶5(SUMO specific peptidase 5,SENP5)。SENP5是SENP特异性蛋白酶家族中的一员,主要通过介导蛋白的去SUMO修饰参与细胞周期、细胞自噬和凋亡等多种生物学过程。SENP5表达失调可能导致细胞功能障碍并诱发癌症。已有多项基于临床肿瘤样本的研究报道,SENP5在肝癌、鼻咽癌和卵巢癌等肿瘤中高表达,且高表达SENP5的患者预后不良。然而,关于SENP5在肿瘤放射敏感性的研究较少,其介导的去SUMO修饰是否参与以及如何调控肿瘤放射敏感性尚不明确。因此,本研究致力于探究SENP5在结直肠癌放射抵抗中的作用及其潜在机制。二、研究内容及方法(一)敲低SENP5对结直肠癌细胞放射敏感性的影响使用实时荧光定量逆转录PCR(Quantitative Real-time PCR,q PCR)和蛋白免疫印迹(Western blot)实验方法检测正常肠道上皮细胞和结直肠癌细胞中SENP5 mRNA和蛋白表达水平。通过免疫荧光和Western blot实验,检测照后SENP5在结直肠癌细胞的亚细胞定位和蛋白表达变化。我们在HCT116和HT29细胞中构建了SENP5敲低结直肠癌细胞系,以探究SENP5在肿瘤放射抵抗中的作用。通过CCK8、克隆形成实验、细胞凋亡和周期实验对比SENP5敲低组和对照组的细胞放射敏感性。(二)SENP5在DNA损伤修复中的作用转录组测序分析照射后对照组和SENP5敲低组细胞mRNA变化,发现DNA复制和损伤修复相关的基因表达下调。利用彗星电泳和γ-H2AX免疫荧光染色检测SENP5敲低细胞的DNA损伤情况。同源重组(Homologous recombination,HR)修复和非同源末端连接(Non-homologous end-joining,NHEJ)修复报告系统用于测定SENP5敲低细胞中HR和NHEJ的修复效率。通过免疫荧光和Western blot实验,我们进一步检测DNA损伤修复通路关键蛋白表达变化。在体内实验中,我们利用结直肠癌细胞系移植瘤模型(Cell derived xenograft,CDX)探究SENP5对体内肿瘤组织放射敏感性的调控作用。最后,我们在SENP5敲低细胞中过表达野生型和去SUMO修饰功能缺失型SENP5开展挽救实验,通过CCK8、克隆形成实验、彗星电泳以及Western blot实验,评估SENP5的去SUMO修饰功能在DNA损伤修复中的作用。(三)SENP5调控DNA损伤修复的靶分子鉴定及功能研究通过SUMO蛋白组学联合SENP5免疫共沉淀质谱分析,初步锁定SENP5调控的靶蛋白H2A.Z。在H2A.Z敲低的细胞中过表达野生型SENP5,通过克隆形成实验检测肿瘤放射敏感性。随后,在HCT116和HT29细胞中,利用H2A.Z抗体进行免疫共沉淀实验检测H2A.Z与SENP5的相互作用。在293T细胞中,通过外源性免疫共沉淀实验检测二者的相互作用。此外,通过H2A.Z免疫沉淀实验检测照射后对照和敲低SENP5细胞中SUMO修饰变化。紧接着,通过染色质免疫共沉淀实验测序(Chromatin Immunoprecipitation sequencing,ChIP-seq)探究敲低SENP5对H2A.Z介导基因转录调控的影响。将H2A.ZGenetic circuits ChIP-seq数据联合转录组测序数据分析,探究SENP5下调对HR修复通路的影响。最后,利用q PCR、WErdafitinib核磁estern blot和免疫荧光实验,探究照射后SENP5敲低细胞中HR修复关键蛋白在DNA损伤修复应答情况。(四)SENP5在直肠癌患者放疗抵抗中的作用及相关性研究通过对直肠癌患者的肿瘤组织芯片进行SENP5免疫组化检测,并结合肿瘤退缩分级评分,我们探究SENP5与直肠癌放射敏感性的相关性。根据SENP5的表达程度将患者分为高表达组和低表达组,并根据临床随访资料绘制患者的生存曲线。为了进一步探究下调SENP5对直肠癌肿瘤组织放射敏感性的调控作用,我们构建患者来源的肿瘤移植瘤模型(Patient derived xenografts,PDX),监测小鼠体重和瘤体体积,对瘤体进行γ-H2AX免疫组化染色。深入了解SENP5在调控直肠癌放射敏感性的作用。三、研究结果(一)敲低SENP5可以增加结直肠癌细胞放射敏感性相对于正常肠道上皮细胞,结直肠癌细胞中SENP5的蛋白和mRNA表达水平均显著升高。因此,我们选择了SENP5高表达的结直肠癌细胞株(HCT116和HT29)进行后续的实验研究。照射后,我们观察到SENP5在细胞中表达量升高,并定位于细胞核。相比于对照组细胞,SENP5下调的结直肠癌细胞照射后增殖能力显著抑制,克隆形成率明显降低。流式分析结果表明,SENP5敲低细胞照射后G2/M周期阻滞减轻,细胞凋亡率增加。(二)SENP5通过其去SUMO功能域促进HR修复而增强辐射抵抗彗星电泳实验提示敲低SENP5加重照射后细胞DNA损伤程度,γ-H2AX免疫荧光染色表明SENP5敲低细胞的DNA损伤修复能力减弱。HR/NHEJ报告系统提示SENP5下调对NHEJ修复没有明显影响,但可以显著抑制HR修复。进一步免疫荧光实验发现,SENP5敲低细胞中HR修复关键蛋白RAD51 foci明显减少,而NHEJ修复关键蛋白53BP1 foci没有显著变化。Western blot实验也发现,SENP5敲低细胞中HR修复关键蛋白ATR、CHK1和CHK2的磷酸化程度降低。同样,在结直肠癌CDX模型中,敲低SENP5的移植瘤生长速度显著降低,且对照射更敏感。免疫组化结果也显示,照射后SENP5敲低结直肠癌移植瘤的HR修复受到显著抑制。最后,在SENP5敲低细胞中的挽救实验表明,过表达野生型SENP5可以减轻照射引起的增殖抑制并促进HR修复。然而,过表达去SUMO修饰功能缺失型SENP5则无此效果。(三)SENP5通过H2A.Z去SUMO化促进HR修复关键蛋白转录调控SUMO修饰蛋白组学联合SENP5蛋白质谱筛选出SENP5作用靶蛋白H2A.Z,并鉴定出其SUMO修饰位点(K121/K122/K126)。H2A.Z敲低细胞中进行SENP5功能挽救实验表明H2A.Z是SENP5促进放射抵抗的主要效应蛋白。随后,内源性和外源性免疫共沉淀实验表明照射后SENP5与H2A.Z结合。然而,位点突变型H2A.Z(H2A.Z-K121R/K122R/K126R)不与SENP5相互作用。H2A.Z免疫沉淀实验表明,照射后SENP5敲低细胞中SUMO修饰水平增加。紧接着,H2A.Z ChIP实验发现与对照组细胞相比,照射后SENP5敲低细胞中H2A.Z与HR修复基因TOPBP1、BRCA2和BARD1启动子结合增加。在照射后的SENP5敲低细胞中,TOPBP1、BRCA2和BARD1的mRNA和蛋白表达水平降低,细胞核内foci数量减少。(四)SENP5可以作为临床放疗标志物和潜在治疗靶点临床直肠癌患者组织芯片结果表明,对于肿瘤组织高表达SENP5的患者,放疗抵抗程度更高,且预后较差。在PDX模型中,敲低SENP5可以明显抑制移植瘤的生长速度。免疫组化染色显示,敲低SENP5可以加剧肿瘤细胞DNA损伤,抑制肿瘤组织增殖。四、研究结论综上,本研究表明SENP5是结直肠癌细胞放射抵抗的关键分子。在体内和体外实验中发现,敲低SENP5可以抑制HR修复,加重INCB018424照射后肿瘤细胞DNA损伤。通过挽救实验,发现SENP5介导的去SUMO修饰在放疗抵抗中发挥重要作用。此外,我们发现SENP5通过调节H2A.Z的去SUMO修饰促进肿瘤细胞放疗抵抗。在SENP5敲低细胞中,H2A.Z与HR修复关键基因TOPBP1、BRCA2和BARD1启动子的结合增加,导致这些分子的mRNA和蛋白表达水平降低,在DNA损伤位点的募集减少,从而抑制HR修复。临床组织芯片数据表明,SENP5表达与患者预后呈负相关。直肠癌PDX模型也进一步验证敲低SENP5可以增加肿瘤的放射敏感性。这些研究揭示了SENP5在DNA损伤反应中的分子机制,为开发潜在的结直肠癌放疗生物标志物和治疗靶点提供新的理论依据。

目的 探讨右美托diABZI STING agonist配制咪定对缺氧诱导的结直肠癌细胞增殖和侵袭的影响以及对缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)信号通路的调节作用。方法 Caco2细胞分为常氧组和缺氧组，CCK8检测细胞在12 h、24 h和48 h的增殖活性，Transwell实验检测侵袭细胞数，qRT-PCR法检测HIFTerrestrial ecotoxicology-1α和VEGF mRNA表达水平，蛋白印迹法检测HIF-1α和VEGF蛋白表达水平；Caco2细胞在缺氧条件下，含不同浓度(0,5,10,20,40μmoL)右美托咪定的培养基进行培养，CCK8法检测细胞增殖活性，Transwell实验检测侵袭细胞数，qRT-PCR法检测HIF-1α和VEGF mRNA表达水平，蛋白印BYL719溶解度迹法检测HIF-1α和VEGF蛋白表达水平。结果 缺氧组细胞在不同时间点的增殖活性均高于常氧组(P<0.05);缺氧组侵袭细胞数多于常氧组(P<0.05);缺氧组HIF-1α和VEGF mRNA及蛋白表达水平均高于常氧组(P<0.05);缺氧条件下，细胞增殖活性、侵袭细胞数以及HIF-1α和VEGF mRNA及蛋白表达水平均随右美托咪定浓度的升高逐渐降低(P<0.05)。结论右美托咪定可抑制缺氧条件下结肠癌细胞增殖和侵袭，其可能是通过抑制HIF-1α表达发挥作用。

目的：探讨褪黑素（MLT）是否能通过减轻随意皮瓣的铁死亡促进随意皮瓣存活。方法：将20只6～8周龄的雄性C57BL/6小鼠随机分为对照组和MLT组，观察术后3、7 d各组皮瓣存活情况及血流动力学。取皮瓣组织评估水肿情况，通过病理学染色、透射电子显微镜观察、免疫印迹等检测方法探讨MLT对随意皮瓣存活的作用及对铁死亡的调节作用。为探讨核红细胞因子2相关因子2(Nrf2)在MLT抑制随意皮瓣铁死亡中起MCC950体内实验剂量到的作用，使用Nrf2抑制剂ml385作为抑制剂，随机将45只6～8周龄的C57BL/6小鼠分为对照组、MLT组和MLT+ml385组，观察形态学变化并检测相关生化指标变化。结果：各组在术后第3、7天都出现远端皮瓣坏死。MLT组较对照组增加了皮瓣存活面积（P<0.05）及皮瓣血流灌注（P<0.05）。HE染色可见MLT组皮瓣内小血管含量多；Masson染色见真皮层纤维排列规整；免疫组织化Panobinostat小鼠学染色可见MLT组较对照组CD34阳性小血管增多（P<0.05），凋亡相关蛋白减少（P<0.05），抗氧化蛋白含量增加（P<0.05）。透射电镜可见皮瓣组织中铁死亡特征性改变。组织脂质过氧化物（LPO）检测、组织Fe含量检测、谷胱甘肽(GSH)水平以及Western blot结果表明，与对照组相比，MLT组GSH上调（P<0.05），组织Fe积累降低（P<0.05）,LPO减少（P<0.05）。联合使用ml385后，Western blot结果表明，与MLT组比，MLT+ml385组中Nrf2下调（P<0.05），抗氧化指标HO-1下调（P<0.05），抗脂质过氧化指标GPX4下调（P<0.05）,Fe结合蛋白轻链（FTL）下调（P<0.05）。结论：MLT治疗有利于小鼠随意皮瓣的存活；铁死亡是影响随意皮瓣存活的因素之一，抑制铁死亡能够促进随意皮瓣存活；MLT抑制铁死亡依赖于激活Nrf2提高抗氧化能力减轻脂质过氧化并genetic approaches促进Fe代谢。

目的探讨不同高浓度葡萄糖下铁死亡对卵巢癌细胞增殖和迁移能力的影响以及CCM3基因在其中可能发挥的作用。方法结合体内外实验,以不同高浓度的葡萄糖体外MC3抑制剂培养卵巢癌A2780细胞24h,通过平板克隆、细胞划痕和transwell实验监测卵巢癌细胞的增殖和迁移能力变化;通过Calcein AM/PI双染试剂盒对A2780细胞进行双重染色检测卵巢癌细胞的死亡情况;采用JC-10检测卵巢癌细胞的线粒体膜电位变化;用组织铁试剂盒将高价铁转化成亚铁从而测定A2780卵巢癌细胞中的铁含量;用western blot评估GPX4、COX2和CCM3等蛋白给糖干预24h后表达水平的变化;通过裸鼠皮下成瘤实验评估A2780细胞肿瘤形成情况,同时给生成的肿瘤组织进行HE染色以评估荷瘤小鼠的血管生成能力。结果与正常受试者随机血糖临界上限(11.1mM)相比,体外高浓度葡萄糖处理24h后的卵巢癌细胞其增殖、迁移及侵袭能力均受到不同程度的抑制,并伴有细胞死亡、线粒体膜电位异常、细胞内的铁异常积累等现象。在western blot实验中,随着体外给糖浓度的升高,铁死亡关键调节因子GPX4的表达水平被下调,COX2的表达水平增加,同时与细胞凋亡相关的蛋白CCM3表达水平降低。当给予铁死亡诱导剂ML385时也出现相似结果,即GPX4表达水平下调,COX2表达水平上调,但CCM3的表达水平呈相反趋势。在裸鼠皮下成瘤实验中观察肿瘤生长情况和血管生成水平发现给糖组并未有显著性差异,这可能是由于小鼠的操作和个体差异;而ML385处理组随着干预浓度的升高,卵巢癌3-MA细胞的生长能力和血管生成水平由于引起细胞铁死亡而受到抑制。结论高浓度葡萄糖可能通过CCM3基因诱导卵巢癌A2780细胞发生铁死BIOPEP-UWM database亡,并以不同于ML385处理的方式最终导致细胞凋亡从而影响其增殖和迁移能力。

为了探索洋葱蜡粉缺失突变体的特征特性和形态学应用价值，选择20份无蜡粉材料进行田间表型特征观察及叶面蜡质成分分析，并对突变株进行AMG510纯度SSR引物筛选。结果表明，洋葱无蜡粉叶片呈亮绿色，有光泽，遗传分析发现叶片蜡粉受隐性基因控制；突变株表现为苗期长势相对弱，产量与品种特性相关；突变株叶片表现出无或少蓟马危害症状，不使用杀虫剂能够达正常洋葱使用杀虫剂抗葱蓟马的效果，并建立无蜡粉洋葱抗蓟马评价标准；叶表超微结构观察及蜡粉成分分析发现：突变体叶表面蜡粉Renewable biofuel严重缺失，有少量蜡粉，不足为人眼观察到，但在抽薹开花末期，花薹表面有一层淡淡光亮白色蜡粉。气相色谱分析叶表面蜡质主要成分均为酰胺、酚类、酮类、烃类、酯类，但无蜡粉叶片中16-三十一酮含量差异显著，由相对含量52.66%降至2.79%,导致叶表面无蜡粉现象；对MG132半抑制浓度19061单株自交分离的有蜡粉与无蜡粉植株进行SSR引物筛选，引物196和304可作为单株特异标记能够将19061有蜡粉与无蜡粉区分，但不能区分其他无蜡粉与有蜡粉材料。因此，洋葱无蜡粉突变体初步研究为洋葱形态学标记和杂交制种应用、抗葱蓟马研究奠定重要基础。

目的 探讨表观扩散系数(ADC)值对子宫内膜非典型增生及子宫内膜癌保留生育能力治疗疗效评估。方法 回https://www.selleck.cn/products/vx-661.html顾性搜集2015年1月至2021年12月保留生育能力治疗的子宫内膜非典型增生及子宫内膜癌患者资料，所有患者分别于治疗后3个月和6个月行MRI和宫腔镜复查，MRI早于宫腔镜。以宫腔镜病理结果为标准，重复测量方差分析法比较治疗前、治疗后3个月、治疗后6个RAD001抑制剂月病变及相应部位内膜ADC值。结果 子宫内膜癌患者5例，治疗前、治疗后3个月和治疗后6个月的肿瘤及治疗后相应部位内膜ADC值分别为Biomass management(0.8±0.06)×10~(-3)mm~2/s、(1.1±0.03)×10~(-3)mm~2/s、(1.2±0.08)×10~(-3)mm~2/s,三组间ADC值差异均有统计学意义(P<0.05)。子宫内膜非典型增生患者5例，治疗前、治疗后3个月和治疗后6个月的内膜ADC值分别为(1.1±0.06)×10~(-3)mm~2/s、(1.1±0.01)×10~(-3)mm~2/s、(1.3±0.09)×10~(-3)mm~2/s,治疗后3个月和治疗后6个月较治疗前ADC值差异无统计学意义(P>0.05),但治疗后6个月较治疗后3个月ADC值差异有统计学意义(P<0.05)。结论 ADC值可用于子宫内膜癌和子宫内膜非典型增生保留生育能力治疗疗效评估，在治疗后6个月评估更有意义。

目的 分析急性缺血性脑卒CHIR-99021抑制剂中患者血小板计数与白细胞计数、颈动脉狭窄及卒中严重程度的相关性。方法 回顾性分析2018年2月至2021年3月首都医科大学附属北京友谊医院连续收治的445例急性缺血性脑卒中患者的血生化和临床资料，血小板计数分为≥300×10~9/L组(增高组)和血小板计数正常组[(100～300)×10~9/L],比较两组患者实验室指标及颈动脉狭窄和卒中严重程度，采用Pearson法分析Cryptosporidium infection血小板计数与颈动脉狭窄、卒中发病时和第14天美国国立卫生研究院卒中量表(NIHSS)评分的相关性。结果 增高组患者血白细胞计数和中性粒细胞绝对值分别为(8.06±1.80)×10~9/L、5.50±1.57,明显高于正常组[(7.01±2.24)×10~9/L、4STM2457使用方法.64±2.03],差异均有统计学意义(P<0.05)。增高组颈动脉重度狭窄及闭塞患者的比率为87.27%,明显高于正常组(39.49%),差异有统计学意义(P<0.05)。增高组患者卒中发病时和第14天的NIHSS评分分别为(12.98±4.17)、(9.98±3.37)分，均明显高于正常组[(3.43±1.71)、(2.98±1.36)分],差异均有统计学意义(P<0.05)。Pearson分析可见，血小板计数与颈内动脉狭窄比例、卒中后入院时、卒中第14天的NIHSS评分均呈正相关性(r=0.547、0.455、0.407,P<0.05)。结论 急性缺血性脑卒中患者血小板计数高于正常者。血小板计数增高患者白细胞计数和中性粒细胞绝对值明显增高；血小板计数增高与急性缺血性脑卒中患者颈内动脉狭窄程度、卒中严重程度呈正相关。

目的 探讨宫腔镜在绝经后无症状子宫内膜增厚患者中的诊疗价值。方法 回顾性分析绝经后经阴道超声(TVS)检查提示子宫内膜增厚(内膜厚度≥5 mm)且无症状68例患者的临床资料,均实施宫腔镜检查和(或)宫腔镜下手术治疗。分析阴道超声检查、宫腔镜检查及病理诊断疾病类型,阴道超声检查影像改变情况及2例子宫内膜癌患者的检查结果。结果 68例患者病理诊断子宫内膜增生4例,子宫内膜息肉46例,黏膜下肌瘤10例,子宫内膜炎4例,子宫内膜癌2例,其他2例。阴道超声检查子宫内膜增生2例,子宫内膜息肉13例,黏膜下肌瘤1例,子宫内膜炎1例,子宫内膜癌1例,其他1例。宫腔镜检查子宫内膜增生4例,子宫内膜息肉38例,黏膜下肌瘤10例,子宫内膜炎4例,子宫内膜癌2例,其他1例。子宫内膜息肉阴道超声检查影像表现为单纯内膜增厚或合并宫Gefitinib-based PROTAC 3小鼠腔异常回声都占绝大多数,分别为52.2%、37.0%；子宫内膜癌均为50.0%。2例子宫内膜癌患者经宫腔镜检查诊断为子宫内膜癌,后均经手术后子宫切除标本病理诊断为子宫内膜腺癌,其中1例阴道超声提示内膜增厚6 mm, 1例阴道超声提示宫腔混合回声。结论 在绝经后无症状子宫内膜增厚患者中,最常见的子宫内膜病变为子宫内膜息肉,子宫内膜恶性肿瘤亦占一定比例,需引起临床高度重视。临床在进一步诊断Z-IETD-FMK时不能完全依靠B超检查评估子宫内膜厚度,要与临床因素及恶性病变的高危因素相结合,做出个体化判断,结合宫腔镜和组织病理学检查得到准确的诊断非常IGZO Thin-film transistor biosensor重要。

第一部分 热射病大鼠的心功能损伤及炎症反应与铁死亡作用的初步研究目的建立热射病大鼠动物模型,初步探究高温干预过程对大鼠心功能的影响及高温干预后恢复过程中炎性通路蛋白与铁死亡相关蛋白的变化趋势,并寻找出最佳时间点以初步探究热射病与铁死亡之间的联系。方法(1)18只雄性SD大鼠随机分为对照(Control)组与热射病(HS)组,Control组3只,HS组15只。肛温计检测大鼠核心体温;BL-420F生物机能实验系统检测大鼠HR及MAP。(2)将上述HS组大鼠按照不同恢复时长分为0h组,3h组,6h组,12h组及24h组,每组3只。ELISA检测大鼠c Tn I;Western blotting检测不同恢复时间点TLR4、NF-κB、p53、SLC7A11和GPX4蛋白表达水平;超声检测心功能指标:SV、CO、LVPWd和LVPWs;BL-420F生物机能实验系统检测心脏血流动力学指标:LVSP、LVEDP、左+dp/dt_(max)及-dp/dt_(max);H&E染色检测大鼠心肌组织病理学形态结构。(3)24只SD大鼠随机分为Control组、铁死亡抑制剂(Liproxstatin-1)组、HS组与HS+Liproxstatin-1组,每组6只。建模前30 min,Liproxstatin-1组和HS+Liproxstatin-1组腹腔注射liproxstatin-1(10 mg/kg)。免疫荧光染色检测大鼠心肌组织中SLC7A11蛋白表达水平;Western blotting检测大鼠心肌组织中SLC7A11与GPX4表达水平。结果(1)直肠温度检测结果显示,与Control组比较,HS组大鼠高温干预60 min后体温上升速度明显加快,并在180 min时显著增加(P<0.01);BL-420F生物机能实验系统检测结果显示,在高温干预过程中,与Control比较,HS组大鼠高温干预120 min后心率上升速度明显加快,并在180 min时达到峰值(P<0.01);与Control比较,HS组大鼠高温干预60 min后MAP明显升高,在90 min时达到峰值并维持至120 min,120min后MAP显著降低(P<0.05)。(2)与Control组比较,HS组大鼠高温干预后恢复3h时,c TnⅠ含量开始增加,并在恢复12h时显著增加(P<0.01);Western blotting检测结果显示,与Control组比较,HS组在高温干预后恢复12h时大鼠心肌组织中TLR4、NF-κB及p53蛋白表达显著增加(P<0.01),SLC7A11与GPX4蛋白表达显著减少(P<0.01);超声检测结果显示,Control组大鼠SV、CO、LVPWd和LVPWs正常;与Control组比较HS组大鼠SV、CO明显降低(P<0.01),LVPWd与LVPWs明显增加(P<0.01);在高温干预后恢复12h,Control组大鼠血流动力学指标正常;与Control组相比,HS组大鼠LVSP显著下降(P<0.01),LVEDP明显增多(P<0.05),+LVdp/dt_(max)显著下降(P<0.05),-LVdp/dt_(max)明显升高(P<0.05);H&E染色结果显示,Control组心肌结构规整清晰,心肌细胞呈梭形,细胞核居中;与Control组相比,HS组见部分心肌排列紊乱、形态不规则或模糊不清,部分胞质深染肥大,细胞间质可见大量炎性细胞浸润。(3)免疫荧光染色结果显示,与Control组比较,HS组大鼠心肌组织中SLC7A11表达明显减少(P<0.01);与HS组比较,HS+Liproxstatin-1组SLC7A11表达明显PLX3397改善(P<0.01);Western blotting检测结果显示,与Control组比较,HS组大鼠心肌组织中SLC7A11、GPX4表达水平明显下降(P<0.05);与HS组比较,HS+Liproxstatin-1组大鼠SLC7A11、GPX4表达水平明显改善(P<0.05)。结论热射病大鼠核心体温明显增加、心率显著升高并伴有低血压;在高温干预后恢复12h时热射病大鼠心功能明显异常,心肌组织结构严重损伤,TLR4/NF-κB炎性信号通路蛋白高表达,p53/SLC7A11/GPX4铁死亡通路蛋白中,p53表达增加,SLC7A11和GPX4表达减少,据此,高温干预后恢复12h可作为本研究动物实验最佳研究时间点。第二部分 抑制TLR4对热射病大鼠心功能及炎症反应与铁死亡的影响目的通过抑制TLR4探究其在热射病大鼠心功能损伤及炎症反应与铁死亡的作用。方法将36只SD大鼠随机分为Control组、TAK-242组、HS组与HS+TAK-242组,每组9只。建模前30 min,TAK-242组和HS+TAK-242组腹腔注射TAK-242(3 mg/kg)。BL-420F生物机能实验系统检测心脏血流动力学指标:LVSP、LVEDP、+dp/dt_(max)及-dp/dt_(max);超声检测心功能指标:SV、CO、LVPWd及LVPWs;H&E染色检测大鼠心肌组织病理学形态结构;RT-q PCR和Western blotting检测TLR4、NF-κB、p53、SLC7A11和GPX4 mRNA及蛋白的表达水平;免疫荧光染色检测心肌组织中TLR4蛋白表达水平;免疫组织化学检测NF-κB、p53、SLC7A11和GPX4蛋白表达水平;ELISA检测大鼠血清中c Tn I、TNF-α、IL-6和IL-1β含量;试剂盒检测大鼠血清中Fe~(2+)含量。结果Control组大鼠SV、CO、LVPWd和LVPWs正常;与Control组比较TAK-242组大鼠SV、CO、LVPWd和LVPWs无明显差异(P>0.05),HS组大鼠SV、CO明显降低(P<0.01),LVPWd与LVPWs明显增加(P<0.01);与HS组比较,HS+TAK-242组SV、CO增加,LVPWd和LVPWs降低(P<0.05)。Control组大鼠血流动力学指标正常;与Control组比较,TAK-242组大鼠血流动力学指标无明显差异(P>0.05),HS组大鼠LVSP(P<0.01)、+dp/dt_(max)(P<0.05)下降,LVEDP、-dp/dt_(max)增加(P<0.01);与HS组比较,HS+TAK-242组血流动力学指标改善,LVSP、+dp/dt_(max)升高,LVEDP、-dp/dt_(max)降低(P<0.05)。H&E染色结果显示,Control组心肌结构正常;与Control组相比,HS组见部分心肌排列紊乱,部分心肌细胞肥大、胞质深染,细胞间质可见大量炎症细胞浸润;HS+TAK-242组可见心肌细胞排列较HS组整齐,肥大的心肌细胞数量减少,细胞间质仍可见炎症细胞浸润,但较HS组减轻。与Control组比较,TAK-242组大鼠血清中c TnⅠ含量无明显变化(P>0.05),HS组c TnⅠ含量显著增加(P<0.01);与HS组相比,HS+TAK-242组c TnⅠ含量显著减少(P<0.05);RT-q PCR与Western blotting检测结果显示,与Control组比较,HS组大鼠心肌组织中TLR4、NF-κB和p53 mRNA及蛋白表达水平明显增高(P<0.01),SLC7A11、GPX4 mRNA及蛋白表达水平明显下降(P<0.01);与HS组比较,HS+TAK-242组TLR4、NF-κB和p53 mRNA及蛋白表达水平明显降低,SLC7A11和GPX4 mRNA及蛋白表达水平明显升高(P<0.05)。免疫荧光染色检测结果显示,与Control组比较,TAK-242组大鼠心肌组织中TLR4表达无明显差异,HS组部分心肌组织中TLR4表达明显增高;与HS组比较,HS+TAK-242组心肌组织中TLR4表达明显降低。免疫组化结果显示,与Control组比较,TAK-242组大鼠心肌组织中NF-κB、p53、SLC7A11和GPX4表达无明显差异,HS组部分心肌组织中NF-κB、p53表达明显增高,SLC7A11和GPX4表达显著减少;与HS组比较,HS+TAK-242组心肌组织中NF-κB、p53表达明显降低,SLC7A11和GPX4表达显著增多。结论TLR4可作为探究热射病大鼠心功能结构保护机制的重要靶点之一,抑制TLR4可显著改善热射病大鼠心功能损伤和心肌组织结构损伤,其机制可能与TAK-242下调TLR4/NF-κB信号通介导的炎症反应及p53/SLC7A11/GPX4信号通路介导的铁死亡相关。第三部分抑制TLR4/NF-κB信号通路对H9C2大鼠心肌细胞炎症反应与铁死亡的影响目的探究高温干预对H9C2大鼠心肌细胞形态结构及活力影响,并明确TLR4/NF-κB信号通路在高温干预导致的心肌细胞炎症反应与铁死亡中的作用。方法(1)37℃组、41℃组、43℃组和45℃组。免疫荧光检测α-actinin标记的H9C2细胞的细胞形态结构;CCK-8检测不同温度时细胞活力。(2)Control组、2h组、3h组、4h组和5h组(高温干预时间)。免疫荧光检测α-actinin标记的H9C2细胞的细胞形态结构;CCK-8检测不同高温干预时长时的细胞活力。(3)Control组,0h组,3h组,6h组和12h组(高温干预后恢复的时间)。Western blotting检测H9C2细胞中TLR4的表达水平。(4)Control组,HS组(43℃高温干预2h后37℃恢复3h)。RT-q PCR和Western blotting检测H9C2细胞中TLR4、NF-κB、p53、SLC7A11和GPX4 mRNA及蛋白的表达水平;ELISA检测H9C2细胞中TNF-α、IL-6及IL-1β含量。(5)Control组、Liproxstatin-1组、HS组和HS+Liproxstatin-1组。Western blotting检测H9C2细胞中SLC7A11和GPX4的表达水平;试剂盒检测H9C2细胞中GSH和MDA含量。(6)Control组、Liproxstatin-1组、HS组、HS+Liproxstatin-1组和Erastin组。透射电镜检测H9C2细胞中线粒体的形态结构;试剂盒检测H9C2细胞中ROS和Fe~(2+)含量。(7)Control组、TAK-242组、HS组和HS+TAK-242组。RT-q PCR及Western blotting和免疫荧光检测H9C2细胞中TLR4、NF-κB、p53、SLC7A11和GPX4 mRNA及蛋白的表达水平;ELISA检测H9C2细胞中TNF-α、IL-6和IL-1β含量;试剂盒检测H9C2细胞GSH、MDA、ROS和Fe~(2+)含量;透射电镜检测H9C2细胞中线粒体形态结构。(8)Control组、PDTC组、HS组、HS+PDTC组和HS+TAK-242组。RT-q PCR检测TLR4、NF-κB、p53、SLC7A11和GPX4 mRNA表达水平;ELISA检测H9C2细胞中TNF-α、IL-6和IL-1β含量;试剂盒检测H9C2细胞GSH、MDA、ROS和Fe~(2+)含量。结果(1)Control组H9C2细胞呈长梭形;与Control组相比,41℃时,细胞骨架开始出现皱缩;43℃时,H9C2细胞逐渐呈不规则形;45℃时,H9C2细胞呈不规则球囊状。CCK-8结果显示,在一定时间内,随着干预温度的增加细胞活力逐渐降低,且在43℃和45℃时细胞活力显著降低(P<0.01)。(2)与Control组相比,在一定温度下,随着干预时间的增加,细胞形态逐渐开始变化,由长梭形逐渐变为不规则椭圆形,且细胞活力逐渐降低(P<0.01)。(3)与Control组相比,TLR4在高温干预后恢复3h时表达显著增高(P<0.01),在6h和12h时TLR4的高表达有所恢复(P<0.05)。RT-q PCR及Western blotting检测结果显示,与Control组相比,HS组TLR4、NF-κB和p53 mRNA及蛋白表达水平显著增加(P<0.01)。与Control组相比,HS组H9C2细胞中TNF-α、IL-6和IL-1β含量显著增加;(4)Western blotting检测结果显示,与Control组相比,HS组SLC7A11和GPX4表达显著增加减少;与Control组相比,Liproxstatin-1组SLC7A11和GPX4蛋白表达无显著性差异(P>0.05),HS组SLC7A11(P<0.01)和GPX4(P<0.05)蛋白表达显著减少;HS+Liproxstatin-1组与HS组相比SLC7A11和GPX4蛋白表达增加(P<0.05)。与Control组相比,Liproxstatin-1组GSH和MDA含量无显著性差异(P>0.05),HS组H9C2细胞中GSH含量明显减少(P<0.01),MDA含量显著增多(P<0.05);HS+Liproxstatin-1组与HS组相比,GSH含量增加(P<0.01)和MDA(P<0.05)含量减少。(5)与Control组相比,Liproxstatin-1组ROS和Fe~(2+)含量无显著性差异,HS组ROS和Fe~(2+)含量显著增多,Erastin组结果与HS组一致;HS+Liproxstatin-1组与HS组相比,ROS和Fe~(2+)含量减少。与Control组相比,Liproxstatin-1组线粒体无明显改变,HS组线粒体变小,线粒体膜密度增高,Erastin组线粒体的变化同HS组一致;HS+Liproxstatin-1组线粒体的形态结构较HS组得到改善。(6)与Control组相比,TAK-242组TLR4、NF-κB、p53、SLC7A11和GPX4 mRNA及蛋白表达无显著性差异(P>0.05),HS组TLR4、NF-κB和p53 mRNA及蛋白表达显著增加(P<0.01),SLC7A11(P<0.05)和GPX4(P<0.01)mRNA及蛋白表达显著减少;与HS组相比,HS+TAK-242组TLR4(P<0.05)、NF-κB(P<0.05)和p53(P<0.01)mRNA及蛋白的表达减少,SLC7A11(P<0.05)和GPX4(P<0.01)的表达增加。与Control组相比,TAK-242组TNF-α、IL-6和IL-1β含量无显著性差异(P>0.05),HS组TNF-α、IL-6和IL-1β含量显著增加(P<0.001);与HS组相比,HS+TAK-242组TNF-α、IL-6和IL-1β含量明显减少(P<0.01)。与Control组相比,TAK-242组线粒体无明显改变,HS组线粒体变小,膜的密度增高;与HS组相比,HS+TAK-242组线粒体的形态结构较改善;与Control组相比,TAK-242组GSH、MDA、ROS和Fe~(2+)含量无显著性差异(P>0.05),HS组GSH含量明显减少(P<0.01),MDA、ROS和Fe~(2+)含量显著增多(P<0.01);HS+TAK-242组与HS组相比GSH(P<0.05)含量增加,MDA(P<0.01)、ROS和Fe~(2+)含量减少。(7)与Control组相比,PDTC组TLR4、NF-κB、p53、SLC7A11和GPX4 mRNA表达无显著性差异(P>0.05),HS组TLR4(P<0.05)、NF-κB(P<0.01)和p53(P<0.01)mRNA表达显著增加,SLC7A11和GPX4 mRNA表达显著减少(P<0.01);与HS组相比,与HS组相比,HS+PDTC组TLR4 mRNA表达无显著性差异,NF-κB和p53 mRNA表达减少,SLC7A11和GPX4mRNA表达增加(P<0.01),HS+TAK-242组TLR4(P<0.05)、NF-κB(P<0.01)和p53(P<0.01)mRNA表达水平减少,SLC7A11(P<0.05)和GPX4(P<0.05)mRNA表达水平增加;与Control组相比,PDTC组TNF-α、IL-6和IL-1β含量无显著性差异(P>0.05),HS组TNF-α、IL-6和IL-1β含量显著增加(P<0.001);与HS组相比,HS+PDTC组TNF-α、IL-6和IL-1β含量降低(P<0.01);HS+TAK-242组H9C2细胞对TNF-α、IL-6和IL-1β含量的影响与HS+PDTC组保持一致;与Control组相比,PDTC组GSH、MDA、ROS和Fe~(2+)含量无显著性差异(P>0.05),HS组GSH含量明显减少,MDA、ROS和Fe~(2+)含量显著增多(P<0.01);与chronic-infection interactionHS组相比,HS+PDTC组GSH含量增加,MDA、ROS和Fe~(2+)含量减少(P<0.01),HS+TAK-2selleck激酶抑制剂42组结果与HS+PDTC组保持一致(P<0.05)。结论高温干预可使大鼠心肌细胞形态异常且细胞活力下降;铁死亡抑制剂干预可改善高温干预导致的心肌细胞铁死亡;抑制TLR4/NF-κB信号通路可改善大鼠心肌细胞炎性环境及铁死亡,提示高温干预导致的心肌细胞损伤机制可能与TLR4/NF-κB炎性信号通路及p53/SLC7A11/GPX4铁死亡信号通路相关。