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目的：探究妊娠期糖尿病(GDM)患者血清及胎盘组织磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、磷酸化蛋白激酶B(P-AKT)表达水平及与胰岛素抵抗关系。方法：以2022年1-12月本院收治的GDM产妇147例(GDM组)及健康产妇71例(对照组)为研究对象，检测两组血清及胎盘组织PI3K、P-AKT表达水平及血糖和胰岛素抵抗相关指标，分析血清及胎盘组织PI3K、P-AKT表达水平与胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)的相关性及对胰岛素抵抗发生的影响。graphene-based biosensors结果：GDM组血清PI3K(0.81±0.17pg/L)、P-AKT(0.64±0.15pg/L)水平及胎盘组织PI3K(1.09±0.23)、P-AKT(1.52±0.32)mRNA表达均高于对照组(0.34±0.06pg/L、0.30±0.07pg/L、0.54±0.10、0.67±0.13),Pear点击此处son相关分析显示，PI3K、P-AKT表达与HOMA-IR均呈正相关(均P<0.05)。logistic分析显示血清及胎盘组织PI3K、P-AKT表达异常升高是GDM患者出现胰岛素抵抗的危险CX-5461半抑制浓度因素(P<0.05)。结论：GDM患者血清及胎盘组织PI3K、P-AKT表达异常升高，且各指标异常升高是GDM患者出现胰岛素抵抗的危险因素。

目的:探究心肌细胞内不同水平的ROS与细胞死亡的关系,以及PGAM5在ROS诱导的不同细胞死亡中的作用及机制。方法:利用不同浓度的t-BHP干预H9c2不同时间,CCK8和流式细胞术检测细胞死亡率和细胞内ROS水平,建立H9c2细胞死亡模型。Seahorse X9细胞能量代谢仪检测H9c2细胞呼吸耗氧率、细胞外呼吸酸化率、实时ATP生成速率和检测线粒体呼吸功能相关指标。采用Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡水平;Western-Blot方法检测cleaved-caspase 3、caspase 1、cleaved-caspase 1、cleaved-GSDMD、RIP1、RIP3、Keap1、PGAM5的表达;Elisa方法检测MLKL、p-MLKL、GPX4、Fe~(2+)、AIFM1和p-AIFM1的表达;q RT-PCR法检测PGAM5m RNA的表达;免疫荧光法检测PGAM5的定位。构建PGAM5 si RNA干扰质粒,转染H9c2细胞,并在H9c2细胞中验证PGAM5 m RNA和蛋白质的表达变化。抑制PGAM5表达后,利用Western-Blot和Elisa方法观察了对细胞死亡标志物以及p-Drp1-S637和p-Drp1-S616表达的影响,并采用JC-1方法检测了细胞线粒体膜电位水平的变化。采用单因素方差分析的方法进行各组间比较。结果:(1)t-BHP干预浓度为0、50、75、100、125、150μmol/L和干预时间为2h可诱导细胞内ROS呈梯度性升高和细胞存活率梯度性降低,成功构建细胞死亡模型。(2)t-BHP干预诱导细胞线粒体氧化磷酸化耗氧率和糖酵解耗氧率呈下降趋势,线粒体呼吸功能各项指标显著降低;(0-125)μmol/L t-BHP干预后,细胞通过线粒体氧化磷酸化生成ATP的实时速率的比例显著升高,通过糖酵解生成ATP的比例显著降低,150μmol/L t-BHP干预后,通过线粒体氧化磷酸化和糖酵解生成ATP的速率无明显变化。(3)t-BHP从50μmol/L开始诱导细胞凋亡率逐渐升高,从100μmol/L开始诱导cleaved-caspase 3、cleaved-caspase 1、cleaved-GSDMD、Fe~(2+)、LC3 II/I表达升高,p-MLKL、GPX4表达降低;t-BHP从125μmol/L开始诱导Keap1、PGAM5表达升高,p-AIFM1表达降低。(4)t-BHP<100μmol/L时,PGAM5 m RNA和总PGAM5的表达显著降低,t-BHP≥100μmol/L时,PGAM5 m RNA、总PGAM5和剪切型PGAM5的表达显著升高。t-BHP诱导细胞内ROS水平的升高导致PGAM5从线粒体向细胞质易位,线粒体向核周聚集。(5)抑制H9c2细胞中PGAM5的表达,显著逆转了100μmol/L t-BHP干预组中cleaved-caspase 3、LGK-974 IC50cleaved-GSDMD、RIP1、RIP3、Fe~(2+)、LC3 II/I的表达升高,和p-MLKL的表达降低。以及150μmol/L t-BHP干预组中Keap1的表达降低,和p-AIFM1的表达升高。(6)t-BHP≥100μmol/L时,可诱导H9c2细胞中p-selleck合成Drp1-S637的表达逐渐升高。抑制PGAM5的表达后,导致p-Drp1-S616的表达显著降低,MMP的水平显著升高。结论:(1)t-BHP干预可诱导H9cInfected total joint prosthetics2细胞内ROS水平升高。H9c2细胞内低水平的ROS即可诱导细胞凋亡的发生,中等水平的ROS开始诱导细胞焦亡、自噬、铁死亡和坏死性凋亡,而诱导氧死亡需要高水平的ROS。(2)随着细胞内ROS水平的升高,PGAM5逐渐从线粒体向细胞质易位,PGAM5 m RNA和总PGAM5蛋白的表达呈先降低再升高的趋势,中等水平的ROS可以诱导剪切型PGAM5蛋白表达升高。(3)PGAM5参与调控细胞内ROS诱导的细胞凋亡、焦亡、铁死亡、自噬和坏死性凋亡和氧死亡。(4)PGAM5通过影响Drp1-S616的磷酸化介导线粒体裂变,进而导致细胞死亡。

氧化应激的研究对理解动物生活史与生境之间的关系具有重要意义，动物的氧化应激与其代谢密切相关。为研究生境及冬眠对蜥蜴氧化应激及代谢的影响，本实验以高海拔山地分布的秦岭滑蜥(Scincella tsinlingensis)为对照，检测了低海拔荒漠分布的密点麻蜥(Eremias multiocellata)肝脏在非冬眠状态(夏季活动期)抗氧化物酶和代谢酶的基础酶活及糖原含量，并比较了密点麻蜥肝脏在夏季活动期(7月)、冬眠期(12月)和出眠期(4月)这些酶的活力及糖原含量变化，同时用q-PCR法检测了编码肝糖原合成酶(GYS2)、肝型糖原磷酸化酶(PYGL)以及黄嘌呤脱氢酶(XDHPLX5622溶解度)基因的表达。结果表明：与秦岭滑蜥相比，密点麻蜥的超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物mucosal immune酶(GPX)、过氧化氢酶(CAT)及柠檬酸合酶(CS)活力较低，丙二醛(MDA)含量较高，肝糖原含量没有显著差异；冬眠期和夏季活动期密点麻蜥肝脏的SOD、GPX和CAT活力显著低于出眠期，冬眠期CS活力显著高于其他时期，冬眠期和出眠期MDAPS-341细胞培养含量显著低于夏季活动期；冬眠期和夏季活动期糖原含量显著高于出眠期；冬眠期GYS2、PYGL和XDH基因表达显著低于夏季活动期和出眠期；生活于低海拔荒漠地区的密点麻蜥较生活于高海拔山地的秦岭滑蜥具有更低的氧化代谢依赖；密点麻蜥氧化应激抗性和代谢表现出了季节性适应，出眠期而非冬眠期表现出的较高氧化应激水平可能与出眠期代谢恢复有关。本实验结果拓展了对蜥蜴氧化应激适应的认识。

椭圆叶花锚(Halenia elliptica D.Don)是治疗肝胆系统疾病的重要中藏药材之一,在青藏高原地区分布广泛。海拔作为一个重要的地形因子,对植物的生长具有重要影响,植物会对不同海拔环境产生适应性变化。研究椭圆叶花锚对海拔的适应机制,可为椭圆叶花锚最佳适宜分布区提供理论参考。本研究以不同海拔椭圆叶花锚为实验材料,通过转录组学和代谢组学联合分析,揭示椭圆叶花锚应对海拔梯度变化的关键代谢通Flow Cytometers路,主要结果如下:1.利用转录组学分析方法研究海拔对椭圆叶花锚基因表达的影响,经转录测序组装共获得279 190条Unigene,共有179 960条获得功能注释。注释到Nr数据库的Unigene有178 480条;注释到KEGG数据库的Unigene有87 377条;注释到GO数据库29 201条。在不同海拔对比中,HM-1 v HM-2显著差异基因共计47条,上调基因36条、下调基因11条;HM-1 v HM-3显著差异基因共计448条,上调基因263条、下调基因185条。研究结果表明海拔梯度对椭圆叶花锚基因表达量具有显著影响,不同海拔梯度间差异基因数量存在显著差异。经KEGG富集分析发现,差异基因主要富集在内质网蛋白加工、长寿调节途径、细胞凋亡、黑色素生成等代谢通路中。2.利用非靶向代谢组学方法研究不同海拔梯度下椭圆叶花锚代谢物的变化,结果表明,在4个样点共6组对比中,检测到共有代谢物149个,其中正离子模式下70个,负寻找更多离子模式下79个。对差异代谢物进行KEGG富集分析发现,差异代谢产物主要富集在类黄酮生物合成、苯丙烷生物合成、黄酮和黄酮醇的生物合成、柠檬酸循环、色氨酸代谢等通路中。3.转录组学和代谢组学联合分析结果表明,基因表达及代谢物共同富集的代谢通路共15个,其中显著富集的有苯丙烷类生物合成代谢、氨基酸代谢、核苷酸代谢、糖类物质代谢等通路。通过分析发现,苯丙烷类生物合成途径与椭圆叶花锚抗氧化活性及生长发育有关;氨基酸代谢途径通过提高椭圆叶花锚呼吸作用selleck FUT-175和生长素含量来应对高海拔低温低氧环境;糖类物质代谢途径为椭圆叶花锚在高海拔环境中提供能量;核苷酸代谢途径与椭圆叶花锚应对强辐射及低温胁迫相关。这些是椭圆叶花锚应对不同海拔高度环境变化的主要生理调节机制。

【背景】急性肺损伤(ALI)/急性呼吸窘迫综合征(ARDS)是常见的临床急危重症,常继发于脓毒症,导致机体严重的肺部感染和细胞的死亡。研究表明铁死亡参与脓毒症诱导的急性肺损伤。目前急性肺损伤仍缺乏确切的治疗手段。间充质干细胞治疗作为一种新型的治疗方法,已得到广泛的研究,但是在应用到临床时其疗效仍有待提高。对间充质干细胞进行基因编辑是一种提高其治疗效果的有效手段。而TSG-6是间充质干细胞发挥治疗作用的重要旁分泌物质。本研究探讨应用过表达TSG-6基因质粒载体包装的慢病毒侵染的人脐带间充质干细胞对脓毒症诱导的急性肺损伤小鼠的治疗作用以及与铁死亡的相关性。【实验目的】探究过表达TSG-6基因的h UCMSCs对CLP诱导的小鼠急性肺损伤模型的治疗作用及与铁死亡的相关性。【实验方法】(1)人原代脐带间充质干细胞获赠于博品(上海)生物医药科技有限公司,在专用的h UCMSCs培养基中培养,定期于显微镜下观察,细胞持续生长直至融合达80-90%,传代至第3代时取部分h UCMSCs进行流selleck GSK J4式分析,检测与鉴定其表面标志物CD34、CD73、CD90及CD105的表达。(2)构建过表达TSG-6基因的h UCMSCs:慢病毒过表达载体FUW-tet O-lox P-h NANOG经过酶切电泳鉴定后,与扩增得到TSG-6基因的CDS序列通过同源重组构建FUW-tet O-lox P-h TSG-6慢病毒表达载体。载体经双酶切鉴定及测序验证成功后,使用三质粒包装系统将重组质粒FUW-tet O-lox P-h TSG-6与慢病毒辅助包装p MD2.G、ps PAX2和FUW-M2rt TA共转染293T细胞。收集慢病毒并感染h UCMSCs,实时荧光定量PCR(RT-q PCR)检测目的基因在h UCMSCs中的表达。(3)构建小鼠急性肺损伤动物疾病模型:将80只C57BL/6小鼠随机分为4组,分别为假手术组、CLP模型组、CLP+MSCs、CLP+TSG-6-MSCs治疗组,模型构建成功后4小时通过尾静脉注射给药的方式将PBS、MSCs、TSG-6+MSCs按不同分组情况注入小鼠体内,造模后密切观察小鼠的一般情况,于模型成功后24h麻醉小鼠并收集小鼠血浆、肺泡灌洗液及肺组织等样品。(4)通过称量及计算肺组织干-湿重量比、血浆及肺泡灌洗液炎症因子ELISA检测、肺组织HE染色及绘制小鼠生存曲线,明确肺部病变情况,确定造模成功,同时分析MSCs是否对ALI起到治疗作用,并且过表达-TSG-6 h UCMSCs是否在原有基础上提高了MSCs对ALI的治疗能力。(5)选取各组小鼠右肺组织行蛋白免疫印迹法和RT-qPCR检测铁死亡相关指标GPX4、SLC7A11分子表达情况,平行检测肺组织GSH、MDA的含量。【结果】(1)在倒置显微镜下观察,可见h UCMSCs贴壁生长,形态均一且为梭形,细胞呈旋涡状生长,随着培养时间增加细胞呈类纤维细胞样并趋于融合。流式分析表面标志性分子CD34低表达(<0.5%),CD73、CD90、CD105均为特异性表达(分别为96.64%、99.244%、95.87%),说明收集到的间充质干细胞符合鉴定标准;可用其继续完成后续实验。(2)成功构建了FUW-tet O-lox P-h TSG-6慢病毒过表达载体,病毒感染h UCMSCs后RT-q PCR检测到稳定、过表达目的基因。(3)小鼠体内实验中,对比各组HE染色情况可发现,对照组肺泡壁未见增厚、肺泡之间的间隔无充血、增宽,也未见炎性渗出;而疾病模型组肺泡壁所含毛细血管扩张严重,肺泡壁充血,肺泡及肺泡壁内大量炎性细胞浸润,两组MSCs治疗组情况介于对照组和急性肺损伤组之间,并且过表达-TSG-6组治疗效果要优于单纯的MSCs治疗组。与对照组相比,ALI模型组小鼠的肺组织病理切片损伤评分明显增高,而单纯的MSCs治疗组和TSG-6-MSCs治疗组的评分均较ALI模型组有明显降低的趋势,组间差异具有统计学意义(p<0.05),并且TSG-6-MSCs治疗组的评分较MSCs治疗组更低(p<0.05)。(4)对比不同分组的肺组织干-湿比同样可以发现,ALI疾病模型组wet-dry比值明显升高(p<0.05),单纯MSCs治疗组次之(p<0.05),但TSG-6-MSCs治疗组改善最为明显(p<0.05)。(5)对各组血浆和肺泡灌洗液的炎症因子检测结果对比可见,模型组小鼠体内炎症因子IL-6、TNF-α、IL-10的表达水平明显升高,说明盲肠结扎穿孔术成功导致了小鼠体内出现脓毒症,并且出现了急性肺损伤;通过注射MSCs治疗后,小鼠全身及肺部的促炎因子表达水平下降,而TSG-6-MSCs组和MSCs组相比,能更大程度地降低促炎因子的表达,提高抑炎因子IL-10的水平(p<0.05)。(6)生存曲线对比:造模后4-6小时即可观察到模型组小鼠出现畏寒、震颤,抱团取暖等表现,同时双眼、肛门排泄物增多,毛发杂乱,随着时间增加,出现呼吸急促、活动迟Dolutegravir小鼠缓甚至死亡等情况。MSCs的治疗延长了小鼠的生存时间,当MSCs过表达TSG-6后,小鼠的生存率得到提高。(7)分析不同组别肺组织的蛋白免疫印迹、RT-qPCR、免疫荧光染色及GSH、MDA含量检测,发现在CLP模型小鼠中,铁死亡核心蛋白GPX4及SCL7A11表达下调、肺组织谷胱甘肽含量减少、氧化应激产物MDA水平上升,说明在该模型中,肺组织损伤后出现细胞铁死亡;而MSCs注射后铁死亡核心蛋白GPX4及SCL7A11表达上调,GSH含量增加,MDA含量下降;过表达TSG-6可进一步改善铁死亡指标,数据均具有统计学差异(p<0.05)。【结论】(1)实验成功构建了CLP小鼠肺损伤模型Cytogenetics and Molecular Genetics及过表达TSG-6-h UCMSCs。(2)实验结果表明过表达TSG-6的h UCMSCs可加强其免疫调节能力,进一步改善CLP诱导的急性肺损伤;(3)CLP诱导的急性肺损伤存在铁死亡,h UCMSCs可能通过改善小鼠体内炎症水平间接减轻了肺组织铁死亡水平且与GPX4-SL7A11相关,可进一步探索两者之间的具体机制。

目的 探讨恶性肿瘤放化疗中心静脉导管置管Medical extract患者血清肝素结合蛋白(HBP)、肾上腺髓质素前体(proADM)在血流感染监测中的价值。方法 选取2019年1月—2021年1月南通大学附属海安市人民医院恶性肿瘤放化疗治疗中心静脉导管置管后发生血流感染患者52例纳入感染组,未发生血流感染患者selleck Dolutegravir30例纳入未感染组,并将感染组患者依照其28 d内生存点击此处情况分为生存组37例、死亡组15例,比较不同组别血清HBP、pro-ADM表达水平,通过受试者工作特征(ROC)曲线评估血清指标对疾病预后的评估价值。结果 感染组血清HBP、pro-ADM水平高于未感染组(P<0.05);革兰阴性菌感染患者血清HBP水平高于革兰阳性菌感染患者(P<0.05);死亡组感染发生后第1天、第3天、第5天血清HBP、pro-ADM表达水平均高于生存组(P<0.05);感染发生后第3天、第5天血清HBP、pro-ADM联合预测患者预后状态ROC曲线下面积分别为0.840、0.852高于第1天的0.744(P<0.05)。结论 恶性肿瘤放化疗中心静脉导管置管发生血流感染患者血清HBP、pro-ADM水平升高,其动态监测对于患者预后评估具有重要价值。

研究背景:胃癌作为我国最为常见的消化系统恶性肿瘤之一,其死亡率与发病率一直高居前列,全球有将近一半的胃癌患者在中国。近年来虽然诊疗技术取得较大进步,但是由于胃癌本身的高度异质性以及个体差异导致很多患者的预后仍然不容乐观。铁死亡(Ferroptosis)在2012年才被正式命名的,是区别于传统的细胞自噬、细胞焦亡、细胞坏死和细胞凋亡的一种新型细胞程序性死亡方式。铁死亡的本质是细胞内氧化还原状态失衡,发生铁超载、脂质活性氧(Lipid reactive oxygen species,Lipid ROS)积累,线粒体皱缩破裂,最终诱发细胞死亡。当前,诱导肿瘤细胞发生铁死亡已被证实在癌症治疗方面具有非常巨大的潜力。索拉非尼(Sorafenib)是一种酪氨酸激酶抑制剂,临床上主要用于晚期肝癌的靶向治疗。同时,其作为铁死亡诱导剂也被很多文献报道在包括胃癌在内的多种肿瘤中发挥抑癌作用。然而,最近索拉非尼作为铁死亡诱导剂的地位受到质疑。目前,索拉非尼在胃癌中涉及到铁死亡的研究较少,索拉非尼能否诱导胃癌细胞发生铁死亡仍有待明确。激活转录因子家族多个成员被证实在铁死亡的调控中发挥重要作用,但有关激活转录因子2(Activation transcription factor 2,ATF2)的研究仅有一篇,且ATF2在索拉非尼诱导的铁死亡中的具体作用及相关机制也暂未见报道。因此,本课题旨在探索ATF2在索拉非尼诱导的胃癌细胞铁死亡中的作用以及下游的具体分子调控机制,从而为胃癌的临床治疗提供新策略。方法:在第一部分中,首先利用免疫组化和Western blot检测ATF2在胃癌细胞及组织中的蛋白表达情况,并进一步分析ATF2的表达水平与胃癌患者临床病理参数及术后总生存期的关系。紧接着利用慢病毒对ATF2进行稳定过表达或敲低,通过CCK-8实验,Transwell迁移及侵袭实验来评估其表达水平对胃癌细胞增殖,迁移和侵袭能力的影响。在第二部分中,我们将细胞分为3组,即DMSO对照组,索拉非尼加药组和索拉非尼+Ferrostatin-1共同加药组,分别处理AGS和MGC803细胞24小时,然后在显微镜下观察细胞形态变化。通过检测细胞内总ROS、脂质ROS、MDA以及GSH含量来评估胃癌细胞的铁死亡水平。利用透射电镜观察索拉非尼处理后胃癌细胞线粒体微观结构的变化情况。紧接着通过Western blot及免疫荧光染色检测索拉非尼处理胃癌细胞后ATF2的表达情况。最后,调控ATF2表达水平后检测其对索拉非尼处理胃癌细胞后铁死亡相关指标的影响。在第三部分中,首先通过联合转录组测序(RNA-seq)和染色质免疫共沉淀测Tamoxifen小鼠序(Ch IP-seq)来鉴定ATF2的全基因组DNA结合位点以及潜在的转录靶点,并进一periodontal infection步通过Ch IP-q PCR进行验证。然后,利用免疫共沉淀(Co-ImmuRSL3分子量noprecipitation,Co-IP)实验来检测ATF2下游靶基因与铁死亡关键分子SLC7A11之间的相互作用。利用si RNA敲低靶基因的表达,检测SLC7A11的蛋白稳定性以及胃癌细胞铁死亡相关指标的变化情况。在第四部分中,将裸鼠随机分为四组:sh-Ctrl对照组、sh-ATF2组、sh-Ctrl?+索拉非尼加药处理组和sh-ATF2?+?索拉非尼加药处理组,通过建立裸鼠皮下异种移植瘤模型,在动物水平上评估敲低ATF2表达以及与索拉非尼联合使用对胃癌生长的影响。结果:我们发现ATF2在胃癌细胞和组织中异常高表达,并与淋巴结转移(P=0.003)和TNM分期(P=0.034)显著相关。高表达ATF2的患者的预后明显劣于低表达的患者(Logrank P=0.011),ATF2表达水平是胃癌患者的独立预后因素。敲低胃癌细胞中ATF2的表达水平可以显著抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。索拉非尼可以诱导胃癌细胞发生铁死亡,同时在此过程中还伴随着ATF2的激活。敲低ATF2可促进索拉非尼诱导的胃癌细胞铁死亡水平,而过表达ATF2则显示出相反的结果。在机制上,通过RNA-Seq和Ch IP-Seq,我们发现HSPH1可能是ATF2下游的靶基因,并通过Ch IP-q PCR进行了验证。HSPH1与SLC7A11存在互作关系,并可以通过提高SLC7A11的蛋白稳定性来促进其表达。此外,HSPH1表达的敲低部分逆转了ATF2过表达对索拉非尼诱导的胃癌细胞铁死亡的效应。最后,裸鼠皮下异种移植瘤模型的结果表明敲低ATF2表达联合索拉非尼治疗对胃癌生长的抑制效果最好,敲低ATF2表达能有效提高胃癌对索拉非尼的敏感性。结论:敲低ATF2表达可显著促进索拉非尼诱导的胃癌细胞铁死亡,并增强索拉非尼在体外和体内对胃癌的抑制作用。

为探索一品红(Euphorbia pulcherrima)苞片发育过程中类黄酮合成代谢相关基因的表达变化情况，本研究对一品红苞片的不同发育时期与成熟叶片的mRNA进行高通量测序，共获得高质量unigene254 713个，其中长度在800～1 000 bp的unigene为19 064个，1 000～1 200 bp的unigene有13 319个。在一品红苞片花青素合成的关键时期Ⅰ和Ⅱ共筛选差异表达基因5 029个，差异基因主要参与次生代谢合成相关的途径，包括类黄酮合成代谢途径、苯丙氨酸代谢途径；进一步对一品红苞片不同发育时期差异基因的GO功能富集分析发现，差异基因参与的主要生物过程涉及线粒体能量代谢、高尔基体物质运输、次生代谢物合成、糖酵解、光合作用等。KEGG富集分析发现，4个时期的差异基因主要共同富集到植物次生代LY294002谢合成(花青素物质合成)，植物激素信号转导、蛋白质磷酸化、糖酵解、莽草酸途径、二芳基庚酸类和姜酚合成路径等。另外，在一品红苞片发育的4个时期共统计到10 828个简单重复序列标记(simple sequence repeats, SSR)，丰富度最高为单核苷酸，占所有SSR的58.07%，其次为三核苷酸和二核苷酸，分别占总SSR的27.02%和13.36%。综合以上结果，本genetic differentiation研究通过分析一品红苞片叶色转变过程中差异基因表达及差异NN2211代谢途径，为更好地了解一品红苞片物质代谢和基因表达调控机制提供了重要的依据。

选题依据:黄芪多糖是黄芪中免疫调节活性最强,含量最为丰富的物质之一,还具有抗肿瘤,抗糖尿病等多种生物活性。已证明黄芪多糖组分APS-Ⅱ是黄芪发挥免疫活性的主要物质基础。然而由于多糖分子量大,结构难于测定,限制了黄芪多糖构效关系的深入研究。效仿蛋白质结构研究方式,采用自下而上,将多糖降解为寡糖,结合质谱技术,是目前研究多糖结构的重要途径之一。前期课题组采用α-1,4-葡聚糖内切酶将APS-Ⅱ降解为寡糖,将不同聚合度寡糖制备为四个组分1～3糖、3～6糖、7～14糖和10～18糖,通过体外免疫活性筛选发现7～18糖具有较强的免疫活性。对四个组分寡糖进行单糖组成、连接位点以及高分辨质谱负离子解析,发现2～9糖均为α-1→4连接的线性葡聚糖,并得出APS-Ⅱ酶解寡糖的活性与C-2和C-6支化程度密切相关的结论。但前期研究中10糖以上以及糖链分支结构不明确,缺少糖链序列结构信息以及存在的同分异构体的寡糖结构也未能得到解析。全甲基化不仅可以提高糖链在MS检测中的灵敏度,还可以简化糖链分子在MS/MS和MSn中的裂解过程,裂解更具有规律性,适用于糖链序列结构解析。同时全甲基化可以降低糖链极性,使得全甲基化糖链在RP-HPLC反相柱中更容易得到分离,有利于APS-Ⅱ酶解寡糖中同分异构体的分离分析。因此本研究将基于非衍生化和衍生化(全甲基化)两种方式结合高分辨质谱(正离子)对APS-Ⅱ酶解寡糖进行结构解析和验证。研究结果为获取丰富精确的黄芪寡糖结构信息以及为阐明黄芪多糖免疫促进活性的构效关系奠定基础。目的:利用离子色谱,气质(GC-MS)甲基化分析、核磁共振波谱(NMR)对APS-Ⅱ单糖组成,连接方式进行分析,对α-1→4连接葡聚糖2～8糖标品进行非衍生化和全甲基化高分辨质谱裂解规律研究。采用MALDI-TOF-MS对APS-Ⅱ酶解寡糖进行分子量表征并结合高分辨质谱对非衍生化和全甲基化酶解寡糖结构进行解析和验证,找出同分异构体寡糖,明确支链结构信息。研究方法:1.通过DEAE-52对免疫活性组分APS-Ⅱ进行分离纯化,结合离子色谱对APS-Ⅱ中中性和酸性多糖组分进行单糖组成分析,同时采用GC-MS以及NMR对APS-Ⅱ中糖残基连接方式,异头碳构型进行分析。2.对免疫活性组分APS-Ⅱ进行酶降解,采用MALDI-TOF-MS和ESI-Q Exactive-MS高分辨质谱(正离子)对α-1→4连接葡聚糖标品2～8进行裂解规律研究以及对APS-Ⅱ酶解后寡糖进行分子量表征和结构序列解析。3.对α-1→4连接葡聚糖标品2～8和APS-Ⅱ酶解后的寡糖进行衍生化(全甲基化),通过采用MALDI-TOF-MS和ESI-Q Exactive-MS高分辨质谱(正离子)对全甲基化α-1→4葡聚糖标品2～8裂解规律进行研究,以及对APS-Ⅱ酶解后全甲基化的寡糖进行结构解析,包括酶解寡糖同分异构体的解析。研究结果:1.本研究采用离子色谱对APS-Ⅱ单糖组成进行分析,得出水洗组分,0.2 mol·L-1NaCl组分,0.5 mol·L-1NaCl组分和1.0 mol·L-1NaCl组分四个组分单糖组成及摩尔比,表明APS-Ⅱ存在部分酸性糖链,含量占比为10%。水洗组分为中性多糖,主要以葡萄糖为主;在NaCl洗脱组分中首次发现了木糖、甘露糖,盐酸氨基半乳糖、盐酸氨基葡萄糖等单糖种类。对不同浓度NaCl洗脱组分中单糖绝对含量分析得出,推测鼠李糖与半乳糖醛酸存在同一酸性糖链中,阿拉伯糖与半乳糖存在同一酸性糖链中,木糖、甘露糖和葡萄糖醛酸存在同一酸性糖链中,为APS-Ⅱ酸性糖链的结构解析提供单糖组成基础。同时采用GC-MS和NMR对APS-Ⅱ单糖连接方式进行分析,得出APS-Ⅱ中主要存在糖残基连接方式为→4)-(α-D-Glcp-(1→,→6)-α-D-Glcp-(1→,同时存在→4,6)-α-D-Glcp-(1→,→2,4)-α-D-Glcp-(1→等分支位点。1→4 和 1→6 的连接方式与2,6位的分支结构可能是APS-II发挥免疫促进活性的关键结构。2.本研究主要采用MALDI-TOF-MS对1-4连接葡聚糖2～8糖标品进行分子量分析,得到分子离子峰,并通过ESI-Q Exactive-MS高分辨质谱技术对相应分子离子峰进行二级碎片提取,分析1→4连接葡聚糖2～8裂解规律,1→4连接主要发生0,2An跨环断裂,产生质量数为60中性丢失。寡糖分子离子加和物主要为Na+,钠化低聚糖可以观察到3个主要的解离通道,即糖苷键断链、跨环解离(CnH2nOn低聚物中性丢失)和脱水,脱水反应和交叉环解离主要发生在还原端的异头碳上,即跨环断链主要产生A型离子;从跨环解离中性丢失m=18和90表明存在1→3连接;中性丢失m=18和60表明存在1→4连接;中性丢失m=18、60和120表明存在1→6连接。通过内切α-1,4-葡聚糖内切酶对黄芪多糖APS-Ⅱ降解,采用MALDI-TOF-MS对寡糖混合物中寡糖分子量进行表征,根据分子量得出寡糖混合物中主要存在3种类型离子分别为 Hexn,1079.7213(unknownGSK126)+Hexn,947.2261(unknown)+Hexn。但 1079.7213(unknown)+Hexn,947.2261(unknown)+Hexn 两种类型离子通过色谱分离后,通过ESI-QExactive-MS高分辨质谱未能找到对应的二级碎片信息,推测糖链中存在较多酸性糖,色谱分离条件未能将酸性糖链进行分离分析。因此通过ESI-Q Exactive-MS对Hexn中2～14糖进行结构表征。2～5糖为线性α-1→4连接的葡聚糖,6 糖为 α-D-Glcp-1→(4-α-D-Glcp-1)4→6-α-D-Glcp,7 糖为 α-D-Glcp-1→(6-α-D-Glcp-1)5→6-α-D-Glcp,8 糖为 α-D-Glcp-1→(6-α-D-Glcp-1)6→6-α-D-Glcp,9 糖为α-D-Glcp-1→4-α-D-Glcp→(6-α-D-Glcp-1)3→4-α-D-Glcp→(6-α-D-Glcp-1)2→6-α-D-Glcp,10 糖为 α-D-Glcp-1→4-α-D-Glcp→(6-α-D-Glcp-1)3→(4-α-D-Glcp)3→(6-α-D-Glcp)2,11 糖为 α-D-Glcp-1Medication for addiction treatment→4-α-D-Glcp→(6-α-D-Glcp-1)5→(4-α-D-Glcp)2→(6-α-D-Glcp)2,12 糖为 α-D-Glcp-1→4-α-D-Glcp→(6-α-D-Glcp-1)4→(4-α-D-Glcp-1)4→6-α-D-Glcp,13 糖为 α-D-Glcp-1→(6-α-D-Glcp-1)2→4-α-D-Glcp→(6-α-D-Glcp-1)3→(4-α-D-Glcp)6,14糖为α-D-Glcp-1-(4-α-D-Glcp-1)4→(6-α-D-Glcp-1)3→(4-α-D-Glcp)6。其中10～14糖共有结构为→(6-α-D-Glcp-1)3→4-α-D-Glcp-1→。相比于2～8糖,9～14糖中则出现了1→4和1→6两种连接方式共存的糖链。推测1→4和1→6连接共存的葡聚糖链可能为APS-Ⅱ中发挥免疫促进活性的关键结构。3.本研究对全甲基化葡聚糖和黄芪多糖APS-Ⅱ酶解寡糖进行MALDI-TOF-MS分子量表征,并将MALDI-TOF-MS中寡糖分子离子峰在ESI-Q Exactive-MS高分辨质谱中进行分子离子峰的提取以及结构解析。全甲基化葡聚裂解规律表明随着糖链的延长,呈现相同的裂解规律,糖苷键断裂主要产生C型断裂,并伴随丢失一分子甲醇(32)和一分子甲醛(30)的可能性以及结合一分子水丢失48和50的分子量,有的还会丢失两分甲醇和两分子甲醛丢失64和60的分子量。跨环断裂主要为2,4A,3,5A以及1，5X断裂,分别产生丢失148+204n,134+204n以及176+204n的碎片离子,因此相同类型断裂中相邻离子则相差204的倍数。此外还原端糖基发生异头碳引发的跨环断裂主要产生111,155等相差44的碎片离子。2,4A,3,5A跨环断裂均selleckchem BIBW2992符合1→4连接的RDA裂解机理,根据RDA裂解模式可以推断出其它连接方式下糖链裂解的特征碎片离子,1→6连接主要发生0,4A,3,5A跨环断裂,1→2连接主要发生3,5X跨环断裂。2,4A,0,4A分别为1→4糖苷键和1→6糖苷键特征跨环断裂方式,产生148+204n和301+204n的特征碎片离子。根据上述不同连接方式裂解规律,对APS-Ⅱ酶解寡糖聚合度为2～11糖中20种寡糖片段进行解析,其中二糖1种,三糖2种为3a,3b,四糖2种为4a,4b,五糖2种为5a,5b,六糖2种为6a,6b,七糖2种为7a,7b,八糖3种为8a,8b,8c,九糖3种为9a,9b,9c,十糖2种为10a,10b,十一糖1种。二糖,3b,4a,5a,6a,7b,8b,9a,10a以及十一糖解析结果与非衍生解析结果相互验证。二糖,3b,4a,5a,7b和8b线性1→4连接葡聚糖,7a和8a为线性1→6连接葡聚糖,5b,6b,9a,10a,十一糖存在1→6连接和1→4连接两种连接方式,结构分别为 α-D-Glcp-1→4-α-D-Glcp-1→6-α-D-Glcp→4-α-D-Glcp-1→4-α-D-Glcp-1,α-D-Glcp-1→4-α-D-Glcp-1→6-α-D-Glcp-1→(4-α-D-Glcp-1)2→4-α-D-Glcp-1,α-D-Glcp-1→4-α-D-Glcp-1→(6-α-D-Glcp-1)3→4-α-D-Glcp-1→(6-α-D-Glcp-1)3,α-D-Glcp-1→4-α-D-Glcp→(6-α-D-Glcp-1)3→(4-α-D-Glcp)3→(6-α-D-Glcp-1)2,α-D-Glcp-1→4-α-D-Glcp→(6-α-D-Glcp-1)5→(4-α-D-Glcp)2→(6-α-D-Glcp-1)2,8c,9c和10b存在→4,6)-Glcp-(1→分支结构,主链为1→4连接的葡聚糖主链,在还原末端糖残基C-6位存在1→6和1→4两种连接方式共存的支链结构。结构分别为:4α和9b存在→2,4)-Glcp-(l→分支结构,主链为1→4连接或者1→4和1→6两种连接方式共存的葡聚糖链,在还原末端→4)-α-D-Glcp-(1→的2位存在l→2连接的分支结构。结构分别为:推测→4,6)-α-D-Glcp-(1→,→2,4)-α-D-Glcp-(1→等含有分支结构的糖链和1→4和1→6两种连接方式共存的支链结构为APS-Ⅱ发挥免疫活性的关键结构。结论:APS-Ⅱ是黄芪发挥免疫活性的主要物质基础。前期课题组采用α-1,4-葡聚糖内切酶将APS-Ⅱ降解为寡糖,通过体外免疫活性筛选和结构解析得出2～9糖活性差,主要是→4)-α-D-Glcp-(1→糖链,10糖以上活性强但其结构由于质谱采集范围限制未进行解析,且具有免疫活性的分支结构信息不明确,缺少发挥免疫活性的关键结构信息。因此本研究采用“自下而上的”降维思路,将多糖降解为寡糖,采用离子色谱、高分辨质谱(MALDI-TOF-MS、ESI-Q Exactive-MS)、600 M核磁等多种结构表征技术。首次发现了木糖、甘露糖,盐酸氨基半乳糖、盐酸氨基葡萄糖等单糖种类。探究了非衍生化和全甲基化寡糖链1→4、1→6、1→2等不同糖苷键的裂解规律,并对聚合度2～14中23种糖链片段进行解析。其中2～5糖主要为线性1→4连接葡聚糖,还原末端含有1→6连接方式,7～8糖存在线性1→6连接葡聚糖,8～14糖主要为1→6和1→4两种连接方式共存糖链,部分同分异构体寡糖且存在→4,6)-α-D-G1cp-(1→,→2,4)-α-D-Glcp-(1→等具有免疫活性的关键分支结构。随着糖链聚合度的增加分支结构和1→6连接方式的比例均在增加,可能对黄芪多糖发挥免疫活性具有重要的作用。本研究对黄芪寡糖及多糖构效关系的研究以及阐明黄芪多糖发挥免疫活性的药效物质基础具有重要意义,同时也为黄芪寡糖的开发利用和黄芪多糖的质量控制研究提供依据。

目的:探究火麻仁低聚肽的抗疲劳功效，及其作用于雌雄个体间的效果与机制。方法:昆明小鼠雌雄各半，随机分为空白对照组(生理盐水组)、阳性对照组(乳清蛋白组)和低、中、高剂量组，各组灌胃相应药物，灌胃28 d。测定小鼠体重、力竭游泳时间、血乳酸(blood lactic acid, BLA)、血尿素氮(blood urea nitrogen, BUN)、肝糖原(liver glycogen, LG)含量。结果:不考虑性别，火麻仁低聚肽对小鼠体重无显著影响，能明显延长小鼠力竭游泳时间，减少小鼠血乳酸与血尿素氮水平，提高小鼠肝糖原含量。考虑性别因素，中剂量火麻仁低聚肽使雌性小鼠体重显著升高，使雄性小鼠体重显著降低；低剂量火麻仁低聚肽能明显使雄性小鼠力竭游泳时间延长，血尿素氮含量降低，使雌性小鼠体重、力竭游泳时间、肝糖原含量明显升高，血尿素氮含量明显下降；高剂量火麻仁低聚肽使雄性小鼠力竭游泳Pathologic downstaging时间和肝糖原含量明显升高，体重和血尿素氮含量明显降低，而雌性小鼠体重、力竭游泳selleck AMG510时间和肝糖原含量明显升高，血乳酸值和血尿素氮含CX-5461核磁量明显下降。结论:火麻仁低聚肽具有抗疲劳功效，剂量在不同性别中对抗疲劳效果有显著影响。