D3T靶向GPX4调节铁死亡参与小鼠脓毒症所致的肠屏障损伤

目的:通过观察3H-1,2-二硫醇-3-硫酮(D3T)预处理对脓毒症小鼠的肠道屏障损伤的影响,初步探讨铁死亡参与脓毒症所致的肠屏障损伤调节的可能机制,为临床脓毒症诊治提供新思路。方法:采用盲肠结扎穿刺术(CLP)建立小鼠脓毒症模型,3H-1,2-二硫醇-3-硫酮(3H-1,2-dithiole-3-thione,D3T)间接诱导GPX4高表达。32只雄性C57BL/6J小鼠随机分为假手术组(Sham),假手术给药组(Sham+D3T),脓毒症组(CLP),脓毒症给药组(CLP+D3T),每组各8只小鼠。给药组在实验前30分钟,腹腔注射D3T悬液(二甲基亚砜(DMSO)溶解,50mg/kg),假手术组及脓毒症组同时腹腔注射等剂量的DMSO+PBS,术后20小时观察小鼠生存情况,内眦静脉取血测定TNF-α、IL-6表达评估小鼠炎症水平;部分小肠组织行苏木精-伊红(HE)染色观察小肠组织的损伤情况,Western blotting检测肠道紧密连接蛋白ZO-1、Occludin及铁死亡相关NSC125066价格蛋白GPX4、ACSL4及SLC7A11/x CT水平;在72小时生存率观察实验中,64只雄性C57BL/6J小鼠分组及处理同前,每组各16只小鼠,仅统计各组小鼠死亡情况,不作其他处理。结果:1.各组小鼠生存情况:CLP及CLP+D3T组小鼠术后12h开始出现精神萎靡,嗜睡,蜷缩,竖毛,少动,拒食或少食,眼角出现分泌物等症状,上述症状呈进行性加重趋势。而Sham组及D3T组下小鼠术后未出现明显脓毒症症状。在术后72小时生存率观察实验中,Sham及Sham+D3T组小鼠无死亡。CLP组小鼠死亡12只,存活率为33%(Chi-square=14.45,P<0.0001),而CLP+D3T组小鼠死亡5只,存活率较CLP组明显改善,为68%(Chi-square=4.657,P=0.0309)。2.各组小鼠小肠组织病理学变化:CLP术后20小时,Sham及Sham+D3T组小鼠小肠组织结构正常,显微镜下(200X)可见小肠上皮细胞正常排列,无水肿及炎症细胞浸润,绒毛完整丰富。CLP组小肠上皮紧密连接消失,局部炎症细胞浸润,小肠绒毛水肿,可见较多断裂,绒毛完整性消失,小肠Chiu’s评分显著升高(t=9.5,P<0.0001)。CLP+D3T组与CLP组比较,小肠上皮较为完整,绒毛结构尚可辨别,绒毛轻度水肿,部分断裂,较CLP组有明显改善,Chiu’s评分较CLP组相D-Lin-MC3-DMA使用方法比明显降低(t=3.674,P=0.0032)。3.各组小鼠血清炎症介质变化:与Sham组相比,CLP组血清TNF-α及IL-6水平明显升高(TNF-α,t=5.081,P=0.0071;IL-6,t=9.309,P<0.0001)。而CLP+D3T组较CLP组相比,血清TNF-α及IL-6水平有所下降(TNF-α,t=2.981,P=0.0407;IL-6,t=4.078,P=0.0011)。4.各组小鼠小肠组织肠道紧密连接蛋白表达变化:与Sham组相比,CLP组肠道紧密连接蛋白Occludin、ZO-1表达水平明显降低(Occludin,t=11.73,P=0.0003;ZO-1,t=22.29,Pgenetic code<0.0001)。CLP+D3T组较CLP组相比,肠道紧密连接蛋白Occludin、ZO-1表达水平升高(Occludin,t=46.24,P<0.0001;ZO-1,t=7.475,P=0.0017)。5.各组小鼠小肠组织铁死亡相关蛋白表达变化:CLP组GPX4和SLC7A11/x CT蛋白水平明显下降(GPX4,t=15.12,P=0.001;x CT,t=26.40,P<0.0001),ACSL4蛋白水平异常升高(t=7.192,P=0.002)。而CLP+D3T组较CLP组相比,GPX4及SLC7A11/x CT的表达水平有所升高(GPX4,t=31.57,P<0.0001;x CT,t=25.24,P<0.0001),ACSL4表达水平下降(t=6.966,P=0.0022)。结论:D3T通过发挥其抗脂质过氧化特性,减少了脓毒症小鼠炎症因子的释放,缓解炎症反应,减轻脓毒症所致的肠屏障损伤,从而发挥肠屏障保护作用,其作用机制可能与抑制GPX4介导的铁死亡有关。