研究目的:电离辐射(Ionizing radiation,IR)在人类的生产生活中越来越广泛,人们受到IR的损伤风险也随之大大提高。IR会引起相关器官和系统的病理性改变,从而造成机体严重损伤。其中,造血系统对IR高度敏感,是IR后最早出现和最严重的损伤部位之一。IR会引发骨髓(Bone marrow,BM)造血功能障碍,甚至会导致造血系统衰竭。这主要是骨髓造血干祖细胞(Hematopoietic stem and progenitor cells,HSPCs)受到IR损伤后无法维持机体的正常造血所致。然而目前始终缺乏保护辐射损伤后的造血系统的有效手段,故预防和减轻IR导致的造血系统损伤已成为当下亟待解决的重要科学问题。本课题拟通过建立IR对小鼠造血系统损伤模型,使用增强转录反式激活因子-蛋白磷酸酶1B(Enhance transactivator of transcription-protein phosphatase 1B,eTAT-PPM1B)干预建立小鼠造血系统辐射损伤后的保护模型,探究eTAT-PPM1B能否减轻IR导致的造血系统损伤并研究其机制,为预防和保护IR导致的造血系统辐射损伤提供新方法及策略。方法:体内实验:1.将SPF级8周龄C57BL/6小鼠随机分为2组:未辐射对照组和辐射模型组。对模型组小鼠进行4Gy全身X射线辐射建立辐射造血系统损伤模型,对照组不进行辐射。14天后取小鼠右侧股骨和胫骨进行流式分析,左侧股骨和胫骨固定、切片后续进行苏木精和伊红(Hematoxylin and eosin,HE)染色。2.用Cy5-NHS eater标记eTAT/eTAT-PPM1B蛋白,将SPF级8周龄C57BL/6小鼠随机分为2组:对照组(eTAT组)和给药组(eTAT-PPM1B组)。eTAT组和eTAT-PPM1B组分别尾静脉注射Cy5-NHS eater标记好的空质粒eTAT蛋白和eTAT-PPM1B蛋白,注射结束后3h取小鼠双侧骨髓进行流式分析。3.将未辐射SPF级8周龄C57BL/6小鼠随机分为2组:对照组(eTAT组)和给药组(eTAT-PPM1B组)。eTAT组和eTAT-PPM1B组尾selleckchem Smoothened Agonist静脉两次注射eTAT或eTAT-PPM1B蛋白(5mg/kg),两次注射间隔时间4h,注射结束后两组小鼠继续常规饲养。14天后取小鼠右侧股骨和胫骨进行流式分析,左侧股骨和胫骨固定、切片后续进行HE染色。4.将辐射后SPF级8周龄C57BL/6小鼠随机分为2组:对照组(4Gy-eTAT组)和治疗组(4Gy-eTAT-PPM1B组),2组小鼠接受4Gy全身X射线辐射后2h和6h尾静脉注射eTAT或eTAT-PPM1B(5mg/kg),注射结束后小鼠继续常规饲养14天后取材,后续分析同上。体外实验:1.eTAT-PPM1B蛋白在体外培养骨髓细胞中的分布:用Cy5-NHS eater标记eTAT/eTAT-PPM1B蛋白,4℃孵育过夜。将孵育好的蛋白加入提前铺好板的BM中,分别在3h、24h后荧光显微镜下拍照观察荧光染色情况,取细胞做流式分析。2.不同剂量辐射对c-Kit~+细胞数量的影响:为观察辐射对c-Kit~+细胞影响的剂量关系,本课题采用1Gy、2Gy、3Gy和4Gy X射线辐射c-Kit~+细胞,并在辐射后24h对各组细胞进行细胞计数。3.Genetics research不同浓度eTAT-PPM1B对辐射后的c-Kit~+细胞数的影响:在含有c-Kit+细胞培养基中分别给予0、25、50和100nmol/m L的eTAT-PPM1B处理,3h后对细胞进行2Gy辐射,24h后对各组细胞进行计数。4.辐射后c-Kit~+细胞程序性死亡与炎症相关基因的表达量变化:将小鼠c-Kit~+细胞分为对照组(0Gy)与辐射组(4Gy),辐射组进行4Gy X射线辐射,对照组不辐射。24h后采取实时荧光定量PCR(Real-time fluorescent quantitative PCR,q RT-PCR)技术检测程序性死亡与炎症相关基因的表达量变化。5.eTAT-PPM1B对辐射后c-Kit~+细胞数量与相关基因表达量的影响:将c-Kit~+细胞分为eTAT组和eTAT-PPM1B组。两组细胞分别给予eTAT或eTAT-PPM1B(50nmol/m L)处理,3h后进行2Gy X射线辐射。在给药后24h进行细胞计数,并通过q RT-PCR检测细胞死亡与炎症相关基因的表达量变化。结果:1.4Gy辐射后14天小鼠骨髓HE染色结果显示:与未辐射组比较,辐射组骨髓腔内细胞排列较为松散,且骨髓细胞数量减少(P<0.01)。辐射组BM中各类HSPCs比例与数量均有不同程度的改变,其中Lin~-细胞数下降(P<0.01),HPCs细胞比例与细胞数量下降(P<0.001),HSCs细胞数减少(P<0.05),MPP1细胞比例与细胞数量下降(P<0.01),MPP2细胞比例与细胞数量上升(P<0.05)。Lin~-细胞、HPCs、LSK细胞、HSCs、MPP1和MPP3.4(P<0.05)的凋亡比例均有不同程度的升高。2.eTAT-PPM1B经尾静脉注射可以进入骨髓内,体外细胞孵育eTAT及eTAT-PPM1B后也检测到了明显的荧光,说明eTAT及eTAT-PPM1B在体内和体外均能很好地递送到目标位置。3.与未辐射组相比,辐射组的炎症因子IL-18(P<0.001)和IL-1β(P<0.0001)表达升高,凋亡与程序性细胞死亡相关基因RIPK3(P<0.001)、MLKL(P<0.0001)和Caspase-3(P<0.0001)表达均有上升。4.eTAT与eTAT-PPM1B对未辐射小鼠骨髓腔内细胞密度与细胞数量均无影响;eTAT与eTAT-PPM1B对未辐射小鼠骨髓HSPCs的细胞比例及细胞数量无影响,不会增加给药后HSPCs的凋亡比例。5.eTAT-PPM1B能够减少4Gy全身X射线辐射小鼠骨髓损伤:与eTAT组相比,eTAT-PPM1B给药后的辐射骨髓腔内细胞密度变大,数量增加(P<0.05)。Lin~-细胞、HSCs和MPP1的比例在eTAT-PPM1B注射后高于eTAT组(P<0.05);其他HSPCs在两组之间无统计学差异,LSK和MPP3.4在eTAT-PPM1B注射后细胞比例存在上升的趋势;辐射后HSPCs小鼠在eTAT组和eTAT-PPM1B组的凋亡比例均无差异。6.体外实验表明,与未辐射组相比,2Gy X射线辐射后24h的细胞数量降低(P<0.05);与对照组相比较,给药后细胞数量无显著差异。7.辐射后的c-Kit~+细胞数量明显低于未辐射细胞,且未辐射细胞在eTAT-PPM1B处理之后与无明显改变;辐射后细胞在eTAT-PPM1B给药后SCH727965分子式的细胞数量高于eTAT组(P<0.05),这说明eTAT-PPM1B在体外给药后会对c-Kit~+细胞起到辐射保护作用。8.对辐射后细胞进行的q RT-PCR结果显示:程序性细胞死亡相关基因RIPK3、细胞凋亡相关基因Puma及细胞炎症因子IL-1β的表达下调(P<0.05);但MLKL、Bcl2和TNF-α在给药组之间的差异不明显(P>0.05)。这提示eTAT-PPM1B对骨髓中造血干祖细胞的保护机制可能与降低炎症反应,抑制凋亡与程序性细胞死亡有关。结论:1.辐射会导致骨髓中的各类造血干/祖细胞数量减少,比例下降,同时坏死性细胞凋亡途径被激活,引起骨髓抑制。2.eTAT-PPM1B蛋白能够有效传递PPM1B蛋白进入骨髓造血干细胞,保护辐射损伤的造血干祖细胞。