β-1,3-1,4-葡聚糖酶在工业上应用领域宽广,如有效降低面包的老化度与硬度、啤酒中麦汁黏度,以及生物质产品的高效水解产糖。GH16家族β-1,3-1,4-葡聚糖酶通过特异性剪切谷物细胞壁中的β-葡聚糖,可有效解决因其分子量大、粘度高带来的工业生产问题。同时工业生产要求β-1,3-1,4-葡聚糖酶具备高催化活力、耐高温、耐酸碱的特性,然而目前报道的β-葡聚糖酶在极端条件下催化性能差,限制了其在工业生产的多元化应用,因此亟需改造出适于多领域工业生产环境的β-葡聚糖酶。真菌Bispora sp.MEY-1来源GH16家族BisGlu16B为筛选到的宽底物特异性、高活性(以大麦β-葡聚糖为底物活性为34,700±348 U/mg)的β-1,3-1,4-葡聚糖酶,是改良催化特性的理想材料。因此本研究以BisGlu16B为出发材料,旨在改良并获得催化性能较为理想的葡聚糖酶,在维持其高比活的同时提高热稳定性与p H稳定性,并使其在食品及降解生物质领域应用度更广泛。主要研究结果如下:(1)基于表面电荷改良BisGlu16B,得到热稳定性提升的D47A/D213A/D253A优质葡聚糖酶。应用ETSS推断出D47、D213和D253为热性质的关键位点。构建单(D47A、D213A和D253A)和组合突变体(D47A/D213A/D253A)与野生型BisGlu16B进行性质测定并比较。结果表明:在所有改良突变体中,D47A/D213A/D253A热稳定性最强。与BisGlu16B相比,其T_(50)和T_m分别增加7.0°C和4.3°C,在70°C时t_(1/2)是野生型的8.1倍。此外,与BisGlu16B相比,D47A/D213A/D253A催化活性也增加42.5%(42,900±300 U/mg vs.30,100±800 U/mg)。基于分子动力学模拟发现,突变位点A47、A213和A253通过降低总体均方根偏差来增强蛋白刚性。模拟啤酒工艺中降解麦芽时,优质突变体D47A/D213A/D253A与BisGlu16B和商用葡聚糖酶(Ultraflo)处理组相比,效率更高,表现为黏度下降35.5%与90.7%,过滤时间降低30.9%与34.6%,以上结果表明D47A/D213A/D253A相较BisGlu16B在高温下稳定性与催化活性更优,有望成为酿酒中优质葡聚糖酶。(2)基于理性设计和能量优化对BisGlu16B＿ΔC进行分子改良,成功得到催化性能提升的突变体G165K。去掉C端的葡聚糖酶BisGlu16B＿ΔC比活是BisGlu16B的2.5倍,因此设计构建BisGlu16B＿ΔC的突变体,酶学性质的结果表明:突变体G165K热稳定性与催化活力最强,A43P/T59I/G165K的p H泛性最高。在酶的热稳定性方面,突变体G165K在60℃下的半衰期(t_(1/2))为65 min,较野生酶(16 min)提高了4.06倍;T_(50)较野生酶(57℃)提高10℃;催化活力也提高了1.33倍(82,623±800 U/mg vs.62,100±500 U/mg),实现催化效率提高mediastinal cyst的同时增强了酶的热稳定性。在面包发酵实验中,G165K的硬度较WT、商用葡聚糖酶(Ultraflo)和对照组分别降低了2.6倍、2.1倍和8.1倍;老化BMS-354825细胞培养度G165K表现最优,比对照组降低43.52%。以上结果表明突变体G165K在中温发酵环境中催化效率更强,有望成为面包行业的优质用酶。(3)基于定向进化改造BisGlu16B＿ΔC,得到p H与热稳定性同时提高的葡聚糖酶突变体A299W。筛选后发现A299F的p H性质较野生型有所提升。对299位点饱和突变后,发现A299W性质表现最优,p H 6.0的相对酶活有70%(野生型在p H 6.0时,相对酶活为8%),且在p H为12.0时,A299W仍有40%的相对酶活。在60℃下,A299W的催化效率较野生酶提高42.5%(39,900±352 m L·s~(-1)·mg~(-1) vs.18,000±312m L·Pexidartinib浓度s~(-1)·mg~(-1));酶的热稳定性方面,突变体A299W在60℃下的半衰期(t_(1/2))为180 min,较野生酶(16 min)提高了13倍。在催化效率提高的同时,A299W实现p H稳定性与热稳定性的三重提高。酶水解半纤维素产糖实验中,A299W与木聚糖酶协同处理组与木聚糖酶处理玉米芯相比,还原糖含量提高5.3倍,协同增效程度最高为2.4倍,为葡聚糖酶改性生物质工业的机理和方法提供有益的见解,以上结果表明突变体A299W在强碱处理环境中适应性更强,有望成为降解生物质中的优质葡聚糖酶。综上所述,对高比活葡聚糖酶BisGlu16B进行分子改良,得到具有热稳定性强、催化活力高及p H泛性广的突变体,是应用于啤酒生产、面包加工、生物质产糖的优质葡聚糖酶,为探索酶分子改良方法与机理研究提供参考,同时为工业用葡聚糖酶提供了新选择。