目的:1.本研究通过细胞实验,分析“JHZP分解”(精华与糟粕分解)紊乱对肾小球系膜细胞的影响及协日嘎-4干预机制。2.通过尤斯灌流结合HPLC-Q-TOP/MS技术,分析协日嘎-4保护肾功能作用有效物质基础。方法:1.取48只SD大鼠(SPF级),雄性,体重180～220g,适应于环境5天后,根据体重将其随机分为6个小组,每组8只,分别为正常组、模型组、协日嘎-4(低、中、高selleck Captisol剂量)组、阳性对照组。正常组、模型组灌胃0.5%CMC-Na溶液,协日嘎-4(低、中、高剂量)组灌胃相应剂量协日嘎-4 0.5%CMC-Na悬浮液,阳性对照组灌胃肾炎消肿片0.5%CMC-Na悬浮液,连续给药15天,同时每天40℃温浴1h,末次给药后,禁食不禁水24h,除正常组以外,每只大鼠进行麻醉(戊巴比妥钠30mg·kg-1)并结扎幽门。术后大鼠单笼饲养,禁食禁水17h后全部大鼠进行麻醉,取肾脏固定于10%甲醛溶液中,做病理切片备用。取腹主动脉血,离心,取血清-80℃保存,备用于检测生化指标。采用HE染色法对大鼠肾组织进行组织学观察,采用全自动生化仪检测各组大鼠血清指标URE、CRE含量。2.取各组大鼠部分血清56℃水浴灭活30min,微孔滤膜(0.22μm)过滤除菌,将细胞分成7组,分别为正常对照组、正常血清组、模型血清组、协日嘎-4低剂量含药血清组、中剂量含药血清组、高剂量含药血清组及阳性含药血清组。除正常对照组外其余细胞给与对应组别血清,采用CCK-8法检测各组血清对细胞存活率的影响;采用全自动生化仪检测各组细胞上清液中URE、CRE含量;采用Western blot法检测细胞中S1c22a5和Mrps9蛋白表达。3.取12只SD大鼠(SPF级),雄性,体重180～220g,适应于环境5天后,根据体重将其随机分为2组,每组6只,即正常组、模型组。模型组每天40℃温浴1h,连续15天后,禁食不禁水24h,每只大鼠进行麻醉(戊巴比妥钠30mg·kg-1)并结扎幽门。术后大鼠单笼饲养,禁食禁水17h后,全部大鼠进行麻醉,取新鲜胃和十二指肠黏膜,通过Ussing Chamber实验得到协日嘎-4跨膜被吸收成分。采用Phenomenex Omega Polar C18 3.0*100 mm色谱柱,A流动相为H20(含0.05%FA),B流动相为甲醇:乙腈(1:1)梯度洗脱,流速0.3 ml·min-1,进样体积为5 μl;ESI离子源在正负离子模式下采集数据;MS一级质量数范围为80～1300m/z,MS/MS二级碎片采集模式为15 MS/MS 50～1300m/z,IDA信息依赖型采集模式;使用实时动态扣除背景,获得高效率二级子离子;离子源温度为550℃;二级碰撞能量为40±20eV。根据一级高分辨率质谱精确质荷比数据、二级高分辨率质谱碎片离子、OS软件二级高分辨数据库和开源的MS Dial软件对化学成分进行鉴定。结果:1.HE染色结果显示,正常组肾组织整体结构基本正常,组织肾小球结构清晰,未见明显萎缩坏死等变性,肾小管上皮细胞未见明显水肿脱落坏死等变性,未见明显炎症细胞浸润;模型组肾组织整体结构异常,组织肾小球明显萎缩分叶,较多肾小管明显扩张,肾小管上皮细胞轻微水肿,提示造模成功;协日嘎-4低剂量组、中剂量组、高剂量组与阳性对照组均Microbial biodegradation不同程度改善肝组织的病理变化,肾组织整体结构基本恢复正常;生化指标检测结果显示,与正常组比较,模型组CRE、URE(P<0.01)水平显著提高;与模型组比较,协日嘎-4低、中、高剂量组及阳性对照组CRE、URE(P<0.01)水平显著降低;2.细胞存活率检测结果显示,与正常血清组比较,模型血清组细胞存活率明显下降(P<0.01);与模型血清组比较,协日嘎-4低、中、高剂量含药血清干预各组HBZY-1细胞存活率明显升高(P<0.01),阳性血清组细胞存活率有提高趋势,但无统计学意义;生化指标检测结果显示,与正常血清组比较,模型血清组CRE、URE(P<0.01)含量显著提高;与模型血清组比较,协日嘎-4各剂量含药血清干预组及阳性血清组CRE(P<0.01)含量显著降低,协日嘎-4低剂量及高剂量含药血清干预组URE(P<0.05)含量明显降低,协日嘎-4中剂量含药血清干预组selleck抑制剂和阳性血清组URE含量有降低趋势,但无统计学意义;蛋白印迹实验结果显示,与正常血清组比较,模型血清组Slc22a5(P<0.05)、Mrps9(P<0.01)含量显著降低;与模型血清组比较,协日嘎-4各剂量含药血清干预组及阳性血清组Slc22a5(P<0.01)含量显著升高,协日嘎-4低剂量及阳性血清组Mrps9(P<0.01)含量极显著升高,协日嘎-4高剂量含药血清干预组Mrps9(P<0.05)含量显著升高;3.HPLC-Q-TOP/MS技术测定结果显示,正负离子模式下,共鉴定出协日嘎-4成分167个,其中黄酮及其糖苷类20个、萜类及皂苷类24个、糖类5个、生物碱类15个、氨基酸及其它有机酚酸类35个、其它类68个;跨膜被吸收成分为74个,其中黄酮及其糖苷类5个、萜类及皂苷类8个、糖类3个、生物碱类9个氨基酸及其它有机酚酸类21个、其它类28个。协日嘎-4含量较高的前10个成分有盐酸小檗碱、黄柏碱、姜黄素、栀子苷、黄柏碱异构体-1、去甲氧基姜黄素、去二甲氧基姜黄素、3-O-Feruloylqu inic acid、西红花苷-I+Na、Trehalose。跨膜被吸收含量较高的前10个成分有栀子苷、京尼平、D-无水葡萄糖、Trehalose盐酸小檗碱、黄柏碱、黄柏碱Phellodendrine异构体-1、甜菜碱 Betaine、Galactonic acid、Tauroursocholic acid、D-(-)奎宁酸、[(2R)-3-hydroxy-2-oxoniopropyl]2-(trimethylazaniumyl)ethyl phosphate、D ecylbenzene sulfonate、Xanthine、烟酰胺、次黄嘌呤。比较各成分在大鼠正常肠黏膜、模型肠黏膜、正常胃黏膜、模型胃黏膜前后含量变化趋势,初步判断协日嘎-4保护肾脏的主要有效成分为:盐酸小檗碱、黄柏碱、黄柏碱异构体-1、栀子苷、D-(-)奎宁酸、京尼平、Trehalose等。结论:首先幽门结扎法有效复制大鼠肾损伤,其损伤机制可能与MRPS9蛋白有关联。其次协日嘎-4可有效干预幽门结扎性肾损伤且低剂量协日嘎-4的疗效最显著。最后初步推测协日嘎-4盐酸小檗碱、黄柏碱、黄柏碱异构体-1、栀子苷、D-(-)奎宁酸、京尼平、Trehalose等为保护肾脏主要活性成分,且上述有效物质的被转运可能与SLC22A5蛋白转运功能相关。