第一部分LncRNA MEG3在POCD小鼠模型中通过抑制炎性因子改善动物认知功能目的:术后认知功能障碍(Postoperative cognitive dysfunction,POCD)是一种临床常见的术后并发症,此种并发症可明显延迟患者出院、加重患者的经济负担,会对患者的预后和中远期生活质量造成明显的负面影响,额外占用患者家庭和社会两方面大量的可用资源。尽管针对POCD的研究很多,但其发病机制复杂,具体的发病机制仍不清楚。因此目前对POCD尚缺乏有效的预防以及治疗措施。长链非编码RNA(Long non-coding RNA,LncRNA)是一种核苷酸长度在200个以上的非编码RNA。近年来,也有部分学者试图阐明lncRNA在POCD中的作用及其机制,但关于lncRNA MEG3在POCD中发挥怎样的功能及通过何种分子机制影响POCD尚不得而知。本部分研究拟构建POCD小鼠模型,探究lncRNA MEG3在POCD中的表达情况及过表达MEG3在POCD小鼠中对动物认知功能、炎性因子分泌、小胶质细胞激活的影响。方法:本研究采用C57BL/6雄性小鼠以截骨手术建立POCD小鼠模型。对照组小鼠行假手术。采用过表达lncRNA MEG3的慢病毒质粒(Lentiviral overexpression vector of MEG3,LV-MEG3),于POCD建模前接受尾静脉注射lv-MEG3以在小鼠体内过表达MEG3,以lv-NC作为阴性对照。采用RT-qPCR检测小鼠海马组织中的MEG3表达。在动物建模及处理一周后,采用水迷宫实验检测动物认知功能。IBA-1荧光染色检测小胶质细胞活化情况。酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测POCD小鼠海马组织匀浆液中炎性因子TNF-α及IL-1β的表达。结果:1)在POCD小鼠海马组织中,MEG3的表达相比对照组降低了近50%,两组间差异具有显著性(P=0.0024)。2)水迷宫实验结果表明,POCD模型小鼠相比对照小鼠于目标象限的时间显著降低,其差异具有统计学意义(P<0.001)。而在小鼠体内过表达MEG3后,相比lv-NC组小鼠,lv-MEG3过表达组的小鼠其于目标象限的时间显著升高,其差异具有统计学意义(P=0.026)。同时,POCD小鼠60 s内穿越平台的频率相比对照组小鼠显著降低(P<0.001),而在小鼠体内过表达MEG3后,相比lv-NC组小鼠,lv-MEG3过表达组的小鼠60 s内穿越平台的频率显著升高,其差异具有统计学意义(P=0.0074)。3)POCD小鼠海马组织匀浆液中的TNF-α及IL-1β表达相比对照小鼠显著升高(P<0.001)。而在POCD小鼠体内过表达MEG3后,lv-MEG3组小鼠海马组织匀浆液中的TNF-α及IL-1β表达相比lv-NC阴性对照组显著降低(P<0.05)。4)在POCD小鼠海马组织中,IBA-1的荧光强度显著升高,相比对照组差异具有统计学意义(P<0.01)。而在采用尾静脉注射过表达MEG3的慢病毒质粒lv-MEG3于小鼠体内过表达MEG3后,lv-MEG3组小鼠海马组织中IBA-1的荧光强度相比lv-NC阴性对照组显著降低,其差异具有统计学意义(P<0.01)。结论:1.MEG3在POCD小鼠体内低表达。2.过表达MEG3改善了POCD小鼠的认知功能。3.过表达MEG3降低了POCD小鼠海马组织的炎性因子分泌并抑制了小胶质细胞的炎性活化。第二部分LncRNA MEG3在LPS诱导的BV-2小胶质细胞模型中对炎性反应、氧化应激及miR-106a-5p/SIRT3轴的调控目的:在POCD的发展过程中,小胶质细胞诱发的炎性反应扮演着极为关键的角色。小胶质细胞炎性活化可释放出大量炎性因子,同时激活炎性通路和氧化应激通路,最终造成微环境中的神经元损伤,导致神经损伤并引发认知功能障碍。但目前为止,POCD中小胶质细胞的炎性活化受到何种分子通路的调控并不明确。在前一部分研究中,我们阐明了lncRNA MEG3在POCD小鼠模型中对小鼠认知功能的改善作用及其对小鼠海马组织中炎性反应及小胶质细胞炎性活化的抑制作用。在本部分研究中,我们拟采用BV-2小胶质细胞,以LPS诱导建立炎性诱导的细胞模型,同时探究MEG3在LPS诱导的小胶质细胞模型中对miR-106a-5p/SIRT3轴、炎性因子分泌及氧化应激的调控作用。方法:使用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导BV-2细胞建立炎性模型。于LPS诱导的BV-2小胶质细胞中采用pc DNA3.1-MEG3转染细胞以过表达MEG3。采用RT-qPCR检测细胞中的MEG3、miR-106a-5p及SIRT3表达。采selleck HPLC用蛋白印迹检测SIRT3的蛋白表达。IBA-1荧光染色检测小胶质细胞活化。采用ELISA检测细胞上清中TNF-α及IL-1β的表达。购买剂盒检测各组细胞中丙二醛、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶浓度。双荧光素酶报告分析检测lncRNA MEG3与miR-106a-5p间的结合关系。结果:1)在LPS诱导的BV-2细胞中,炎性因子TNF-α、IL-1β的表达都显著升高,且与对照组细胞相比差异具有统计学意义(P=0.0033及0.0019)。同时,MEG3的表达显著降低,其差异相比对照组细胞具有统计学意义(P=0.0379)。2)RT-qPCR结果表明转染pc DNA3.1-MEG3的BV-2细胞其MEG3表达显著增加(P<0.001),表明细胞转染成功建立了MEG3过表达的模型。ELISA结果表明,LPS的诱导显著升高了BV-2细胞中TNF-α、IL-1β的表达(P<0.001)。而在细胞中过表达MEG3后,TNF-α及IL-1β的表达都显著降低,其差异与LPS+pc DNA3.1的阴性对照组相比具有统计学意义(P<0.001)。3)在LPS诱导的BV-2细胞中,IBA-1的荧光强度显著升高,对比对照组细胞的差异具有统计学意义(P<0.001)。而在过表达MEG3后,表达升高的MEG3显著降低了LPS诱导的BV-2细胞中的IBA-1的荧光强度,相比LPS+pcDNA3.1的阴性对照组其差异存在统计学意义(P<0.001)。4)促氧化应激因子MDA的表达在LPS诱导的BV-2小胶质细胞中表达显著升高,其相对对照细胞差异具有统计学意义(P<0.001)。而在采用pc DNA3.1-MEG3过表达MEG3后,MDA的表达相比LPS+pc DNA3.1阴性对照组其表达显著降低,其差异具有统计学意义(P<0.001)。LPS诱导的BV-2小胶质细胞中抗氧化应激SOD及GSH-PX的表达显著降低,在用pc DNA3.1-MEG3过表达MEG3后,SOD及GSH-PX的表达显著升高,且相比LPS+pc DNA3.1阴性对照组差异具有统计学意义(P=0.0142)。5)生物信息学分析平台Starbase预测了MEG3与miR-106a-5p间的结合位点。在MEG3-WT野生型的293T细胞中,荧光素酶活性在过表达miR-106a-5p时显著降低(P<0.05),而在MEG3-MUT突变型的细胞中过表达miR-106a-5p则对荧光素酶活性无显著影响。RT-qPCR及蛋白印迹的结果表明,在BV-2细胞中过表达MEG3显著降低了miR-106a-5p的表达(P<0.05),同时过表达MEG3显著升高了SIRT3的m RNA和蛋白质表达(P<0.001)。结论:1.过表达MEG3可以抑制LPS诱导的BV-2小胶质细胞中的炎性反应。2.过表达MEG3可以抑制LPS诱导的BV-2小胶质细胞中的氧化应激反应。3.MEG3可与miR-106a-5p结合并负调控miR-106a-5p/SIRT3轴。第三部分miR-106a-5p通过调控SIRT3逆转lncRNA MEG3在POCD中对炎性因子分泌及氧化应激的抑制作用目的:虽然已有lncRNA对小胶质细胞炎性因子分泌及氧化应激的调控作用,但lncRNA MEG3通过何种分子信号通路影响小胶质细胞的炎性反应及氧化应激,进而影响POCD的发展还不甚明了。miR-106a-5p已在一些研究中被证明可以促进炎性进程,而其下游的靶标m RNA SIRT3则已被诸多研究发现可发挥抗炎、抗氧化作用。但目前,并无研究关注miR-106a-5p/SIRT3通路在POCD中与MEG3的相互作用及其对POCD中小胶质细胞炎性及氧化应激的影响。在本部分研究中,我们通过POCD动物模型及LPS诱导的BV-2细胞模型,探究miR-106a-5p/SIRT3在POCD及BV-2炎性细胞中的表达情况,同时探究过表达miR-106a-5p对MEG3影响BV-2细胞的逆转作用,同时阐明SIRT3在此作用中扮演的角色。方法:研究采用C57BL/6雄性小鼠以截骨手术建立POCD小鼠模型。对照组小鼠行假手术。采用LPS诱导的BV-2小胶质细胞建立体外模型。RT-qPCR检测miR-106a-5p及SIRT3在POCD小鼠海马组织及LPS诱导的BV-2小胶质细胞中的表达情况。ELISA检测细胞上清中TNF-α及IL-1β的表达。市售试剂盒检测各组细胞中MDA、SOD、GSH-PX的含量。采用生物信息学分析平台Targetscan预测miR-106a-5p与SIRT3之间存在的结合位点。双荧光素酶报告分析Drug immunogenicity检测了miR-106a-5p在293T细胞中与SIRT3的结合作用。结果:1)在POCD小鼠海马组织中,miR-106a-5p的表达相比对照小鼠显著升高且差异具有统计学意义(P=0.0021)。而SIRT3在POCD小鼠的海马组织中表达显著降低,相比对照小鼠具有统计学意义(P=0.0025)。在LPS诱导的BV-2小胶质细胞中,miR-106a-5p的表达也显著升高,且相比对照组细胞其差异具有统计学意义(P=0.0247)。而SIRT3在LPS诱导的BV-2小胶质细胞中的表达则显著降低,且差异相比对照小鼠具有统计学意义(P=0.0076)。2)在LPS诱导的BV-2细胞中过表达MEG3显著降低了TNF-α及IL-1β的表达水平,其差异相比阴性对照组具有统计学意义(P<0.001)。在过表达MEG3的同时采用miR-106a-5p mimics转染BV-2细胞则显著升高TNF-α及IL-1β的表达,其差异相比单独过表达MEG3具有统计学意义(P<0.001)。3)在LPS诱导的BV-2细胞中过表达MEG3显著降低了MDA的表达水平,其差异相比阴性对照组具有统计学意义(P<0.001)。在过表达MEG3的同时采用miR-106a-5p mimics转染BV-2细胞则显著升高MDA的表达,其差异相比单独过表达MEG3具有统计学意义(P<0.001)。相反,在LPS诱导的BV-2细胞中过表达MEG3显著升高了抗氧化因子SOD及GSH-PX的表达水平,其差异相比阴性对照组具有统计学意义(P<0.001)。在过表达MEG3的同时采用miR-106a-5p mimics转染BV-2细胞则显著降低了SOD及GSH-PX的表达,其差异相比单独过表达MEG3具有统计学意义(P<0.05)。4)生物信息学分析平台Target Scan预测了miR-106a-5p与SIRT3的结合作用。在SIRT3-WT野生型的293T细胞中,荧光素酶活性在过表达miR-106a-5p时显著降低(P<0.05),而在SIRT3-MUT突变型的细胞中过表达miR-106a-5p则对荧光素酶活性无显著影响。RT-qPCR及蛋白印迹的结果表明,在BV-2细胞中过表达miR-106a-5p显著降低了SIRT3的表达(P<0.05)。结论:1.miR-106a-5p在POCD小鼠海马组织及LPS诱导的BV-2小胶Tezacaftor配制质细胞中表达都显著升高,而SIRT3表达则显著降低。2.miR-106a-5p逆转MEG3在LPS诱导的BV-2小胶质细胞中对炎性因子分泌及氧化应激的抑制作用。3.miR-106a-5p可以与SIRT3结合并负调控其表达。