研究背景系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)是一种慢性、系统性自身免疫性疾病,临床表现具有明显的异质性,可累及多系统,造成多器官损害。SLE病因与发病机制复杂,至今尚未完全阐明。N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine,m6A)甲基化修饰是真核生物中重要的表观遗传修饰方式之一,在不改变碱基序列的前提下,动态可逆地调控RNA的转录、加工、剪接、翻译和降解过程,已被证实与多种自身免疫性疾病的发生发展密切相关。长链非编码RNA(long noncoding RNA,lnc RNA)是一类长度超过200个核苷酸且不编码蛋白质的RNA,能够在免疫细胞的发育、分化和激活过程中发挥重要作用,进而调控机体的先天性和适应性免疫,已被确定为SLE有效的治疗靶点和生物标志物。m6A甲基化修饰通过调控lnc RNA表达而发挥致病作用,已在多种疾病中得到证实,但国内外研究对于m6A甲基化修饰调控的lnc RNA参与SLE发病机制的研究却鲜有报道。目的筛选在SLE中受m6A甲基化修饰调控的lnc RNA,评估其作为SLE辅助诊断生物thoracic oncology标志物的价值,并研究其在SLE发病中的潜在机制,以期为SL更多E病因学研究和疾病防制提供新的思路。方法本研究联合分析SLE患者和健康对照外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)中甲基化RNA免疫共沉淀结合高通量测序(methylated RNA immunoprecipitation sequencing,Me RIP-seq)和RNA高通量测序(RNA-sequencing,RNA-seq)数据,筛选出6个m6A甲基化修饰相关的lnc RNA。采用实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction,q RT-PCR)技术进行大样本病例对照验证,并利用χ~2检验和Spearman相关分析3个差异lnc RNA与SLE患者临床特征的关联,且采用受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线分析评估其作为SLE诊断生物标志物的价值。此外,采用q RT-PCR和Western blot检测m6A甲基化酶在SLE患者和健康对照中m RNA和蛋白的表达,并采用Spearman相关分析其与差异lnc RNA表达的相关性。在Jurkat细胞中敲减甲基化酶METTL3后,应用q RT-PCR技术检测LINC02035表达水平,并采用Me RIP-q PCR检测METTL3与LINC02035是否存在相互作用。采用核质分离法检测LINC02035在Jurkat细胞中的亚细胞定位后,利用生物信息学分析技术预测,并通过双荧光素酶基因报告实验、q RT-PCR和Western blot验证LINC02035、mi R-107和PTEN的结合和调控关系。通过CCK-8和流式细胞术研究其对Jurkat细胞的增殖和细胞周期的影响。最后,通过回复实验验证,LINC02035是否通过mi R-107调控PTEN/AKT,进而对Jurkat细胞的增殖产生影响。结果第一阶段:SLE患者PBMCs中m6A甲基化修饰相关lnc RNA的筛选共筛选出6个m6A甲基化修饰相关的lnc RNA,分别为GSKJ4临床试验CYTOR、LINC02035、LINC00847、LINC01001、LINC02446和ERVK13-1。第二阶段:SLE患者PBMCs中验证候选m6A甲基化修饰相关lnc RNA和甲基化酶的表达(1)在102例SLE患者和107例健康对照的PBMCs中对6个候选lnc RNA的表达水平进行验证,结果表明,与健康对照相比,SLE患者PBMCs中LINC02035、LINC00847和ERVK13-1的表达均显著下调(均有P<0.05)。进一步分析3个差异表达的lnc RNA在PBMCs中的表达与SLE患者临床特征间关联性发现,LINC02035的表达与心包炎、脓尿、血肌酐有关(均有P<0.05);LINC00847的表达与抗ds-DNA抗体、血红蛋白有关(均有P<0.05);ERVK13-1的表达与脱发、心包炎、抗CENPB抗体有关(均有P<0.05)。此外,ROC曲线分析结果显示,SLE患者PBMCs中LINC02035和ERVK13-1 ROC曲线下面积均大于0.700,分别为0.704和0.719。(2)在74例SLE患者和74例健康对照PBMCs中验证甲基化酶的表达,结果发现,METTL3、METTL14、WTAP、FTO的表达均降低(均有P<0.05),其中METTL3的表达量最低,且SLE患者PBMCs呈低m6A甲基化状态(t=-3.663,P=0.003),故本研究选择METTL3为本研究的m6A甲基化酶。而且SLE患者PBMCs中METTL3的蛋白表达水平也低于对照组(t=4.936,P=0.008)。第三阶段:SLE患者T细胞中验证PBMCs中差异的lnc RNA和甲基化酶METTL3的表达(1)在102例SLE患者和102例健康对照的T细胞中对PBMCs中差异表达的3个lnc RNA进行进一步验证。结果表明,与健康对照相比,SLE患者T细胞中LINC02035、LINC00847和ERVK13-1的表达均显著下调(均有P<0.05)。进一步分析3个差异表达的lnc RNA在T细胞中的表达水平与SLE患者临床特征间关联性发现,LINC02035的表达与雷诺现象、管型尿、抗C1q抗体、血小板计数、疾病活动度评分有关(均有P<0.05);LINC00847的表达与发热、皮疹、服用糖皮质激素、抗C1q抗体、疾病活动度评分有关(均有P<0.05);ERVK13-1的表达与发热、管型尿、服用糖皮质激素、抗C1q抗体、疾病活动度评分、高密度脂蛋白胆固醇有关(均有P<0.05)。此外,SLE患者T细胞中LINC02035和ERVK13-1 ROC曲线下面积最高大于0.700,分别为0.715和0.731。(2)在46例SLE患者和46例健康对照的T细胞中验证m6A甲基化酶METTL3的表达发现,在SLE患者T细胞中METTL3的m RNA(Z=-3.514,P<0.001)和蛋白(t=3.116,P=0.036)表达均低于对照组。第四阶段:METTL3可调控LINC02035的m6A甲基化修饰(1)74例SLE患者PBMCs中,METTL3与LINC02035、LINC0847、ERVK13-1的表达均呈正相关(均有P<0.05),其中LINC02035与METTL3相关系数最大(r_s=0.811,P<0.001)。46例SLE患者T细胞中,METTL3和LINC02035的表达量也呈正相关(r_s=0.844,P<0.001)。(2)与对照组相比,敲低METTL3的Jurkat细胞中LINC02035的表达显著降低(t=5.911,P<0.001)。此外Me RIP-q PCR实验结果表明,METTL3与LINC02035存在相互作用(t=-4.993,P=0.038)。第五阶段:m6A甲基化修饰相关的lnc RNA LINC02035的功能研究(1)感染sh-LINC02035后,Jurkat细胞的增殖能力增强。(2)LINC02035主要分布于细胞质,双荧光素酶结合报告证实其可以与mi R-107直接结合,且敲低LINC02035可显著上调Jurkat细胞中mi R-107表达(t=-10.248,P<0.001)。此外,SLE患者T细胞中mi R-107的表达显著升高(Z=-4.808,P<0.001),且LINC02035与mi R107的表达呈负相关(r_s=-0.428,P=0.023)。(3)转染mi R-107 mimic后,Jurkat细胞的增殖能力增强。(4)双荧光素酶结合报告证实mi R-107和PTEN可直接结合,且过表达mi R-107后,Jurkat细胞中PTEN m RNA和蛋白表达均降低(均有P<0.05)。SLE患者T细胞中PTEN的表达下降(Z=-3.247,P=0.001),且mi R107与PTEN的表达呈负相关(r_s=-0.538,P=0.001)。(5)转染si-PTEN后,Jurkat细胞的增殖能力增强。(6)感染sh-LINC02035后,Jurkat细胞中PTEN m RNA和蛋白表达均降低(均有P<0.05)。且SLE患者T细胞中LINC02035与PTEN的表达呈正相关(r_s=0.596,P=0.001)。(7)回复实验结果表明,低表达LINC02035抑制PTEN的表达,促进AKT的磷酸化,且促进Jurkat细胞的增殖(均有P<0.05);而共转染sh-LINC02035和mi R-107 inhibitor后,PTEN表达升高,p-AKT蛋白表达下降,Jurkat细胞的增殖能力也降低(均有P<0.05)。结论(1)发现3个m6A甲基化修饰相关的lnc RNA与SLE的发病有关,分别为LINC02035、LINC00847和ERVK13-1。(2)PBMCs和T细胞中LINC02035和ERVK13-1有望作为SLE潜在的生物标志物。(3)LINC02035受m6A甲基化修饰调控,并通过海绵吸附mi R-107而促进靶基因PTEN的表达,抑制AKT磷酸化,进而抑制T细胞增殖。