目的:通过(1)构建糖尿病肾病模型,研究miR-155表达对足细胞结构和功能的作用;(2)细胞水平验证miR-155作用于ROCK/MLCK信号通路,调节并影KD025体内实验剂量响足细胞结构和功能的机制,从而进一步了解糖尿病肾病足细胞损伤发生发展的过程,为寻找新的诊断标志物和治疗靶点提供依据。方法:(1)体外培养人肾小球足细胞,用相差显微镜观察细胞形态学特征,细胞免疫荧光法检测足细胞特异性蛋白nephrin、synaptopodin,以验证实验用的细胞为人肾小球足细胞。(2)用30mmol/L的D-葡萄糖溶液刺激足细胞48h作为实验(HG)组,同时以终浓度为5mmol/L的D-葡萄糖溶液处理细胞48h作为正常对照(NC)组。CCK-8法检测足细胞增殖活性,RT-qPCR检测mRNA和miR-155的表达,Western blot法检测蛋白的表达,鬼笔环肽染色观察细胞骨架变化,细胞免疫荧光检测nephrin、synaptopodin蛋白。(3)慢病毒转染72h,使细胞miR-155过表达和敲低,用3.5μg/ml的嘌呤霉素刷选出稳定株,利用RT-qPCR法检测miR-155的表达。(4)将细胞分组为:NC组、HG组、HG+miR-155OE组、HG+miR-155 OE NC组、HG+miR-155 KD组和HG+miR-155 KD NC组,CCK-8法检测足细胞增殖活性,RT-qPCR检测mRNA和miR-155的表Canagliflozin说明书达,Western blot法检测蛋白的表达,同时检测ROCK/MLCK通路相关蛋白ROCK1、ROCK2和MLCK蛋白的表达,鬼笔环肽染色观察细胞骨架变化,细胞免疫荧光检测nephrin、synaptopodin蛋白。结果:(1)通过显微镜观察的细胞形态学特征和足细胞特异性荧光蛋白证实实验用的细胞为人肾小球足细胞。(2)正常对照组中miR-155的表达量较低,30mmol/L的D-葡萄糖溶液作用于足细胞48h后,miR-155表达上调;与正常对照组相比较,细胞增殖活性受到抑制,细胞活性降低;nephrin等mRNA的表达均明显下调;HG组nephrin等蛋白与NC组相比较,均明显降低;激光共聚焦显微镜观察足细胞骨架显示:NC组足细胞骨架排列有序,结构清晰,沿细胞长轴呈放射状分布,荧光强度明亮Forensic genetics,而HG组足细胞形态发生改变,变圆钝、皱缩,骨架结构断裂,排列紊乱,较NC组相比较,荧光强度表达稍暗淡;细胞免疫荧光结果显示,足细胞nephrin蛋白主要在胞膜、细胞质及核周中表达,呈颗粒或线装分布,HG组nephrin蛋白荧光与NC组相比较,表达量减少,荧光减弱。Synaptopodin只在分化成熟的足细胞中表达,主要分布在胞浆、周边、次级突起,HG处理后的足细胞,Synaptopodin蛋白荧光减弱,部分向核周分布。(3)MOI=10和感染增强剂P的条件下进行慢病毒转染过表达miR-155,MOI=100和感染增强剂A的条件下进行慢病毒转染敲低miR-155,用3.5μg/ml的嘌呤霉素浓度培养,刷选出miR-155 OE稳定株和miR-155 KD稳定株,在miR-155 OE稳定株中miR-155的表达水平升高,在miR-155KD稳定株中miR-155的表达水平降低。(4)在足细胞损伤中,miR-155 OE组中miR-155的表达水平显著升高;细胞增殖活性受到明显抑制,细胞活性显著降低;nephrin等mRNA的表达均明显下调;nephrin等蛋白表达均明显降低;然而ROCK/MLCK通路相关蛋白ROCK和MLCK蛋白表达上升;共聚焦显微镜观察到细胞形态破坏明显,骨架结构排列混乱,荧光强度表达明显暗淡;nephrin蛋白荧光表达量显著减少,荧光明显减弱;Synaptopodin蛋白荧光显著减弱。(5)在足细胞损伤中,miR-155 KD组中miR-155的表达水平降低;细胞增殖活性增强,细胞活性增高;nephrin等mRNA的表达均明显升高;nephrin等蛋白表达均明显升高;ROCK/MLCK通路相关蛋白ROCK和MLCK蛋白表达下降;共聚焦显微镜观察到细胞形态正常,骨架结构整齐清晰,足突明显,荧光强度明亮;nephrin蛋白荧光表达量增加,荧光明显增强,Synaptopodin蛋白荧光显著增强。结论:1.miR-155在高糖诱导足细胞损伤模型中表达升高,过表miR-155可以促进足细胞损伤,敲低miR-155可逆转这一过程。2.在糖尿病足细胞损伤时,ROCK通路相关因子ROCK1、ROCK2和MLCK通路相关因子MLCK表达量升高,miR-155过表达可促进其表达,miR-155敲低可逆转这一过程;ROCK和MLCK通路可能参与miR-155调控高糖诱导足细胞损伤过程。