背景:帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是第二大常见的神经退行性疾病,其病理特征主要以黑质致密部多巴胺能神经元的(Dopaminergic neurons,DA)丢失以及路易小体的形成造成。临床上,主要表现分运动症状(运动迟缓、静止性震颤、肌僵直等)和非运动症状(睡眠障碍、抑郁、焦虑、认知障碍、言语障碍等),能够给患者及家庭带来严重的危害和难以承担的经济负担。流行病学调查结果显示,我国老年人群PD的发病居多,发病率约为1%,每年死亡人数超过10万以上,其发病机制复杂且临床上没有良好的治疗手段,因此对PD的干预治疗以及其作用机制的探究具有重要的社会和经济意义。micro RNA(miRNA)是一类高度保守的非编码RNA,通过与靶m RNA的3′非翻译区(3′UTR)的互补位点结合且在基因表达调控中发挥核心作用。大量研究证实miRNA参与了包括帕金森病在内的多种神经退行性疾病的发生与发展过程,有研究表明,miR-22通过抗氧化和抗凋亡作用减轻缺血再灌注损伤;另外,miR-22通过抗凋亡机制对亨廷顿病具有神经保护作用,但是miR-22在PD中的作用鲜有报道。因此,本实验主要探索miR-22对帕金森小鼠模型运动功能的影响以及是否发挥保护多巴胺能神经元的作用并探究其作用机制。目的:通过在体和离体实验,明确miR-22能否改善PD小鼠的运动功能障碍以及发挥对多巴胺能神经元的保护作用;进一步探讨miR-22对PD小鼠多巴胺能神经元保护的作用机制,为临床PD的治疗和诊断提供新的策略。方法:离体实验:1.离体实验采用人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y),用1-甲基-4-苯基吡啶(1-Methyl-4-phenyl Ridinium IoCCRG 81045溶解度n,MPP~+)诱导PD细胞模型;使用miR-22mimic进行细胞干预实验。2.应用CCK-8技术检测miR-22 mimic对MPP~+诱导的SH-SY5Y细胞活性的影响。3.应用免疫荧光技术检测miR-22 mimic对MPP~+诱导SH-SY5Y细胞凋亡的影响。在体实验:1.在体实验采用健康,雄性C57BL/6J小鼠,体重20-25g。使用1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP)诱导PD小鼠模型,应用过表达miR-22的腺病毒脑立体定位注射至纹状体区进行干预实验。2.应用转棒实验检测miR-22对MPTP诱导的PD模型小鼠运动协调能力与平衡功能的影响。3.应用旷场实验检测miR-22对MPTP诱导的PD模型小鼠自主探究行为的影响。4.应用Cat Walk步态分析系统检测miR-22对MPTP诱导的PD模型小鼠步态参数的影响。5.应用Western blot技术检测miR-22对MPTP诱导的PD模型小鼠纹状体区及黑质区多巴胺神经元蛋白表达水平的影响。6.应用免疫荧光技术检测miR-22对MPTP诱导的PD模型小鼠形态学的影响。7.应用Western blot和免疫荧光技术验证miR-22对MPTP诱导的PD模型小鼠对多巴胺能神经元起保护作用的可能机制(凋亡、氧化应激、神经炎症)。在体实验:结果:离体实验1)miR-22对MPP~+诱导的SH-SY5Y细胞具有保护作用。CCK-8检测结果显示,与对照组相比,MPP~+模型组细胞活性明显降低,miR-22 mimic处理后,细胞活性显著增加。2)miR-22能够抑制细胞凋亡。为了探究miR-22是否能够抑制MPP~+引起的细胞凋亡,我们应用了免疫荧光技术检测细胞凋亡的情况,结果显示,与Control组相比,模型组细胞凋亡显著,给予miR-22 mimic处理后,细胞凋亡明显改善。在体实验:1)miR-22能够改善MPTP诱导的PD模型小鼠的运动能力。探究miR-22对MPTP诱导的PD模型小鼠的运动能力的影响。转棒实验结果显示,与Control组相比,MPTP模型组小鼠在棒停留时间明显缩短;经miR-22干预后,小鼠在棒停留时间有所增加。接着,我们采用经典的Cat Walk步态分析系统进一步观察miR-22对MPTP诱导的PD模型小鼠步态的影响。我们发现,与对照组相比,PD模型小鼠表现出明显的运动迟缓及运动协调能力下降,主要通过某特定距离所用时间(run duration)、单脚支撑时间(single stance)、脚步周期(step cycle)等参数显著增加,而平均速度(average speed)、摆动速度(swing speed)显著降低;在过表达miR-22后,这些指标与模型组相比都有明显改善。2)miR-22能够改善MPTP诱导的PD模型小鼠的探究行为。旷场实验显示,与Control组相比,MPTP模型组小鼠的运动总距离、移动频率和中心区域停留时间减少,给予miR-22病毒过表达干预后,PD模型小鼠运动总距离、移动频率和中心区域停留的时间有增加的趋势。同时,我们还发现MPTP模型组小鼠自主活动性显著降低,活动大部分局限于旷场周边,小鼠探究行为显著减弱;给予miR-22病毒过表达干预后其探究行为显著增加。3)miR-22能够减轻MPTP诱导的PD模型小鼠多巴胺能神经元的丢失。应用Western blot及IF技术检测多巴胺神经元的表达情况,结果显示,与Control组相比,PD模型组黑质致密部多巴胺神经元的数量及纹状体区多巴胺能神经纤维的数量明显减少,在给予miR-22病毒过表达干预后,神经元确认细节丢失的情况有所改善。4)miR-22通过抑制氧化应激反应发挥神经保护作用。为了进一步探究miR-22对MPTP诱导的PD模型小鼠神经保护作用机制,我们从凋亡、神经炎症、氧化应激三个角度入手,结果显示MPTP诱导的PD模型小鼠具有显著的氧化应激反应:还原型谷胱甘肽、过氧化物酶两种指标检测升高,给予miR-22干预能够减轻这种反应,两种指标有所降低。5)MPTP诱导的帕金森小鼠模型中会增加星型胶质细胞的数量。我们应用Western blot及免疫荧光技术检测小鼠黑质致密部和纹状体中星型胶质细胞的表达。结果显示,在黑质致密部和纹状体中,与对照组相比,MPTP模型组mediastinal cyst有显著差异;与MPTP模型组相比,miR-22病毒干预后并没有降低的趋势。6)miR-22能够改善MPTP诱导PD模型黑质致密部小鼠小胶质细胞的形态变化。激活小胶质细胞可引起星型胶质细胞转化为病理性A1形态,从而促进帕金森病等多种神经退行性疾病的发生。因此我们进一步探究MPTP诱导的PD模型小鼠是否存在改变小胶质细胞的形态,以及用miR-22过表达干预是否影响其形态,免疫荧光染色结果显示,与Control组相比,MPTP模型组黑质致密部小胶质细胞的形态有所变化:模型组的胞体变大,突触变短;给予miR-22过表达干预,小胶质细胞的形态有所改善。7)miR-22通过激活PI3K/Akt/m TOR信号通路发挥保护作用。为了进一步探讨miR-22通过何种机制发挥神经保护作用?我们检测了纹状体中PI3K、Akt、m TOR蛋白水平以及各自的磷酸化形式的表达情况,Western blot结果显示,模型组中两种蛋白的表达显著降低,而给予miR-22过表达干预后蛋白表达增加,说明过表达miR-22激活了PI3K/Akt/m TOR信号通路从而发挥其神经保护作用。结论:1.miR-22能够促进神经元存活,并且能够抑制细胞凋亡。2.miR-22能够改善MPTP诱导的PD模型小鼠的运动功能障碍,同时也能够改善多巴胺神经元的丢失。3.MPTP诱导PD模型小鼠中星型胶质细胞的数量有所增加。4.miR-22能够改善MPTP诱导PD模型小鼠小胶质细胞的形态变化,同时能通过抑制PD模型小鼠引起的氧化应激反应,能够激活PI3K/Akt/m TOR信号通路,从而发挥神经保护作用。