第一部分 miR-223-3p在体外内皮细胞损伤模型中的表达及作用机制研究【目的】以人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)和人肾小球内皮细胞(Human renal glomerular endothelial cells,HRGECs)做为糖尿病肾病(Diabetic kidney disease,DKD)体外研究模型,通过高糖刺激诱导内皮损伤,初步探讨miR-223-3p与内皮损伤的相关性,探究miR-223-3p对高糖刺激导致的内皮损伤的调节作用。明确miR-223-3p是否在高糖刺激的内皮损伤中作为重要调控因子,并验证其对靶基因IL6ST及其下游STAT3通路的表达调控。【方法】1、HUVECs用正常葡萄糖(1 g/L)或高糖(6.5 g/L)或甘露醇(6.5 g/L)处理6、12、24小时,甘露醇作为实验渗透压的控制变量,建立高糖刺激导致的内皮损伤细胞模型;运用实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,RTqPCR)检测内皮损伤因子内皮缩血管肽-1、血管性血友病因子和血管内皮生长因子(Et-1、Vwf、Vegfa)和miR-223-3p m RNA相对表达水平。2、用正常葡萄糖或高糖处理敲低或过表达miR-223-3p腺病毒转染的HUVECs和HRGECs细胞,以空载腺病毒为阴性对照;RT-qPCR分析各组miR-223-3p、内皮损伤因子Et-1、Vwf、Vegfa和炎症因子白介素-6(Il-6)m RNA相对表达水平。3、高糖(6.5g/L)处理HUVECs 0、6、12、24h,蛋白质免疫印迹(Western Blot,WB)检测IL6ST蛋白质表达水平;用正常葡萄糖或高糖处理敲低或过表达miR-223-3p腺病毒转染的HUVECs和HRGECs,以空载腺病毒为阴性对照;RTqPCR检测HUVECs和HRGECs中Il6st m RNA相对表达水平,WB检测HUVECs中IL6ST、p-STAT3和STAT3蛋白质表达水平。【结果】1、RT-qPCR检测在高糖刺激的HUVECs中内皮损伤因子Et-1、Vwf、Vegfa的相对表达水平较正常糖和甘露醇组升高(P<0.05),miR-223-3p的相对表达水平明显下降(P<0.05),但正常糖组和甘露醇组的内皮损伤因子Et-1、Vwf、Vegfa及miR-223-3p的表达差异无统计学意义。2、RT-qPCR检测敲低miR-223-3p腺病毒转染条件下用正常糖或高糖处理的HUVECs和HRGECs细胞中miR-223-3p的m RNA相对表达水平明显下调(P<0.01);在空载腺病毒组中,高糖组细胞中内皮损伤因子Et-1、Vwf、Vegfa以及炎症因子Il-6表达量较正常糖组明显升高(P<0.001);正常糖处理条件下,敲低miR-223-3p腺病毒组细胞中内皮损伤因子Et-1、Vwf、Vegfa以及炎症因子Il-6表达量较空载腺病毒组升高(P<0.01);高糖处理条件下,敲低miR-223-3p腺病毒组细胞中内皮损伤因子Et-1、Vwf、Vegfa以及炎症因子Il-6表达量较空载腺病毒组也发生进一步上调(P<0.05)。3、RT-qPCR检测过表达miR-223-3p腺病毒转染条件下用正常糖或高糖处理的HUVECs和HRGECs细胞中miR-223-3p的m RNA相对表达水平明显升高(P<0.01);正常糖处理条件下,过表达miR-223-3p腺病毒组细胞中内皮损伤因子Et-1、Vwf、Vegfa以及炎症因子Il-6表达量较空载腺病毒组降低(P<0.05);高糖处理条件下,过表达miR-223-3p腺病毒组细胞中内皮损伤因子Et-1、Vwf、Vegfa以及炎症因子Il-6表达量较空载腺病毒组也发生下调(P<0.01)。4、WB检测结果显示,IL6ST蛋白质表达水平在高糖刺激的HUVECs细胞中上调。5、RT-qPCR检测敲低miR-223-3p腺病毒转染条件下用正常糖或高糖处理的HUVECs和HRGECs细胞中Il6st的m RNA相对表达水平,在空载腺病毒组中,高糖组细胞中Il6st表达量较正常糖组明显升高(P<0.05);正常糖处理条件下,敲低miR-223-3p腺病毒组细胞中Il6st表达量较空载腺病毒组升高(P<0.05);高糖处理条件下,敲低miR-223-3p腺病毒组细胞中Il6st表达量较空载腺病毒组也发生进一步上调(P<0.05)。6、RT-qPCR检测过表达miR-223-3p腺病毒转染条件下用正常糖或高糖处理的HUVECs和HRGECs细胞中Il6st的m RNA相对表达水平,正常糖persistent infection处理条件下,过表达miR-223-3p腺病毒组细胞中Il6st表达量较空载腺病毒组降低(P<0.05);高糖处理条件下,过表达miR-223-3p腺病毒组细胞中Il6st表达量较空载腺病毒组也发生下调(P<0.01)。7.WB检测过表达miR-223-3p腺病毒转染条件下用正常糖或高糖处理的HUVECs细胞中IL6ST、p-STAT3蛋白质相对表达水平均降低(P<0.01);WB检测敲低miR-223-3p腺病毒转染条件下用正常糖或高糖处理的HUVECs细胞中IL6ST、p-STAT3蛋白质相对表达水平均升高(P<0.05)。【结论】1、高糖刺激成功构建HUVECs细胞内皮损伤模型,高糖刺激下miR-223-3p表达降低,IL6ST蛋白质表达水平上调。2、在HUVECs和HRGECs细胞中,敲低miR-223-3p的表达能够促进高糖导致的内皮损伤,并且伴有炎症反应的发生;过表达miR-223-3p可以改善高糖刺激引起的内皮细胞损伤和炎症反应,表明miR-223-3p可参与调节高糖刺激导致的内皮损伤和炎症反应。3、敲低miR-223-3p可引起靶基因IL6ST及其下游STAT3通路表达水平上调;过表达miR-223-3p可引起IL6ST及p-STAT3表达水平下调;表明miR-223-3p可以通过与IL6ST相互作用,进而调控IL6ST/STAT3信号传导,参与调节高糖刺激导致的内皮损伤。第二部分 miR-223-3p在体内DKD小鼠模型中的作用研究【目的】体外的研究结果证明了miR-223-3p在高糖刺激内皮损伤的进展中是一个关键的调控因子。为了进一步在体内验证miR-223-3p对DKD肾小球内皮损伤的调控作用,通过DKD小鼠探究miR-223-3p是否在DKD肾小球内皮损伤中发挥重要作用,并验证其信号通路IL6ST/STAT3通路在动物模型中的表达。【方法】1、检测15周龄的Wild type(WT)和db/db小鼠的空腹血糖水平、体重水平,(每组n=5);对肾组织切片进行H&E和PAS染色,观察肾小球病理改变和肾小球糖原沉积情况,明确DKD小鼠模型。2、采用RT-qPCR测定WT和DKD小鼠肾皮质中miR-223-3p、Il6st和内皮细胞损伤因子(Et-1、Vegfa、Vwf)的m RNA相对表达水平,(每组n=5);WB检测WT和db/db小鼠肾皮质中IL6ST、p-STAT3和STAT3蛋白质相对表达水平,(每组n=3)。【结果】1、db/db小鼠的体重和血糖与WT相比增加(P<0.001);肾组织切片H&E染色selleck结果提示,与对照组小鼠相比,db/db小鼠肾小球体积增大,有明显的炎症浸润;Dorsomorphin使用方法肾组织切片PAS染色结果表明,肾小球基底膜增厚,糖原沉积明显。2、RT-qPCR检测结果显示DKD小鼠肾皮质中miR-223-3p的相对表达水平降低(P<0.001),Il6st和内皮细胞损伤因子Et-1、Vegfa、Vwf的m RNA相对表达水平均升高(P<0.01);WB检测结果显示,WT和db/db小鼠肾皮质中IL6ST、p-STAT3蛋白质相对表达水平明显升高(P<0.001)。【结论】体内研究中,在DKD小鼠肾皮质中出现明显内皮损伤,并且miR-223-3p表达下调,IL6ST、p-STAT3的表达水平上调;表明miR-223-3p参与了DKD的进展调控,并且可能通过IL6ST/STAT3信号传导调节肾小球内皮损伤。