研究背景:国际疼痛研究协会在2020年对疼痛进行了重新定义,定义为与实际或潜在的组织损伤相关或类似的不愉快的感觉或情感体验,包含了疼痛感觉以及由此导致的情感改变。慢性疼痛作为疼痛的一种类型常与情绪障碍并存,如焦虑、抑郁、睡眠障碍。研究显示,慢性疼痛患者更容易遭受抑郁症的困扰,并且这一现象常被忽视。与此同时,抑郁症增强了慢性疼痛的感知以及延长了慢性疼痛的病程。慢性疼痛和抑郁具有共同的病理生理进程,神经炎症参与共病的发病机制。研究表明,小胶质细胞在中枢神经系统中维持着内环境的稳态,脊髓小胶质细胞在疼痛和抑郁中发挥着重要的作用,炎症刺激小胶质细胞激活,诱导缝隙连接半通道打开,释放三磷酸腺苷(ATP)和神经毒性物质,可触发各种细胞因子释放和产生各种病理反应,最终导致慢性疼痛,神经元损害和抑郁症等脑损伤。国际糖尿病联合会(IDF)糖尿病阿特拉斯第十版提供了2021年全球有5.37亿成年人患有糖尿病,糖尿病是导致过早死亡的首要原因之一。据估计中国有3.88亿人糖尿病前期患者,中国成年人的糖尿病前期患病率高达5.7%。全球卫生支出的12%,即7270亿美元,用于糖尿病及其并发症,2017年中国与糖尿病相关的医疗费用为1100亿美元。慢性低度炎症是糖尿病发病机制中的关键因素。糖尿病前期和糖尿病的全球流行已导致其并发症的相应流行,尚无有效预防或治疗方法,最常见的并发症是糖尿病神经病变。糖尿病神经病理痛(diabetic neuropathic pain,DNP)性神经病变是一种临床常见的周围神经病变。典型的糖尿病痛性神经病变患者可表现为烧灼样疼痛、针刺痛、电击样疼痛等,夜间疼痛明显,严重影响患者的睡眠、生活质量和工作效率。糖尿病神经病理痛性神经病变与其他痛性神经病变发病基础不同,以自发性疼痛、痛觉过敏和异常性疼痛为特征,是疼痛治疗领域的一大难题。抑郁症是最常见的精神障碍,数亿人遭受过这种疾病的折磨,自杀风险率高达15%左右,严重影响着人类的身心健康。共病(comorbidity)是指同一患者同时存在两种及以上慢性疾病,慢性疼痛患selleck激酶抑制剂者常伴随抑郁相关症状。糖尿病并发抑郁症的发病率呈逐年上升趋势。糖尿病神经病理痛与抑郁共病的确切机制不明,有效治疗方法亦未明确。通过实验,综合探讨2型糖尿病神经病理痛与抑郁共病的发病机制及防治研究具有重要意义。铁死亡(Ferroptosis)是由铁依赖的脂质过氧化作用驱动的一种程序性细胞死亡。细胞内铁稳态失衡,致使细胞内二价铁离子增多时,铁离子介导的毒性活性氧(ROS)物质产生增加可诱发铁死亡。谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)活性缺失或表达量降低导致细胞抗氧化能力降低、ROS堆积、脂质过氧化产物丙二醛(malonaldehyde,MDA)增加、线粒体缩小、最终引起细胞氧化性死亡(铁死亡)。当细胞内铁稳态被打破后,过量的controlled infection铁通过芬顿(Fenton)反应将过氧化氢和脂质过氧化物转化为ROS,进而引起铁死亡。铁死亡的过程多伴有炎症的表现,当炎症反应超过一定限度时,大量释放的促炎细胞因子,将导致机体损害。糖代谢与铁代谢密切相关,高糖可导致铁超载,最终导致铁死亡,铁死亡参与糖尿病的病理变化。ATP信号激活P2X7受体引发炎症导致ROS生成增加,组织细胞中ROS的积累是诱发铁死亡的直接原因之一,氧化应激及ROS增加介导糖尿病神经病理痛的病理过程。嘌呤受体包括P1和P2受体,P2受体又可以分为P2X(1-7)受体和P2Y(_(1,2,4,6,11-14))受体。器官或组织损伤时,可将ATP释放于炎性微环境,ATP通过旁分泌或自分泌的方式作为信号分子激活P2受体,影响内环境稳态和炎症反应的发生发展。在P2受体中,P2X7受体在激活淋巴细胞,巨噬细胞和神经胶质细胞反应中具有重要的作用。即使截止到目前,临床研究尚没有定论,但是P2X7受体为抗炎作用的靶向治疗提供了新方向。P2X7受体介导慢性疼痛、糖尿病并发神经病理痛、抑郁症的病理变化,拮抗P2X7受体可改善糖尿病神经病理痛并发抑郁症动物模型的病理变化。目的:1、通过建立慢性缩窄性损伤(CCI)和慢性不可预知性刺激(CUMS)共病大鼠模型,探究没食子酸对疼痛和抑郁共病的作用以及作用机制。2、确定长非编码(lnc RNA)UC.471+的sh RNA是否可抑制海马P2X7受体表达,减轻ROS生成增多引起的神经细胞损伤,进而改善2型糖尿病大鼠神经病理痛和抑郁共病的病理变化。3、通过糖尿病神经病理痛大鼠模型探究Cp G ODN 2088是否对P2X7受体介导的糖尿病神经病理痛产生作用及其相关机制。方法:1、建立慢性缩窄性损伤(CCI)和慢性不可预知性刺激(CUMS)共病大鼠模型,通过检测大鼠机械痛敏与热痛敏疼痛行为变化,检测大鼠糖水偏好率、强迫游泳和旷场试验等抑郁样行为确定模型建立成功。大鼠适应一周后随机分为5组:假手术组(Sham)、Sham+没食子酸对照组(Sham+Gallic acid)、CCI+CUMS模型组(CCI+CUMS)、CCI+CUMS+没食子酸处理组(CCI+CUMS+Gallic acid)和CCI+CUMS+生理盐水溶剂对照组(CCI+CUMS+NS)。分子对接预测没食子酸与P2X7受体的相互作用,实时定量PCR(q RT-PCR)、蛋白印迹法(western blotting)检测大鼠脊髓中P2X7受体和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)表达水平。免疫荧光双标法检测P2X7受体与小胶质细胞标志物OX42共定位,蛋白印迹检测TNF-α转化酶(TACE),核因子κB(NF-κB),磷酸化的信号传导和转录激活因子3(p-STAT3),信号传导和转录激活因子3(STAT3)和GPX4的表达。试剂盒检测谷胱甘肽(GSH)、GPX4、ROS、MDA和组织铁含量。通过透射电子显微镜检测线粒体损伤。2、建立糖尿病神经病理痛合并抑郁症大鼠模型,通过检测大鼠疼痛和抑郁症行为确立模型建立成功。实验分组:正常对照组(Ctrl),糖尿病神经病理痛合并抑郁症模型组(DNP+DP),糖尿病神经病理痛合并抑郁症加lnc RNA UC.471+的短发夹RNA(sh RNA)组(DNP+DP+UC.471+sh RNA),糖尿病神经病理痛合并抑郁症加sh RNA阴性对照处理组(DNP+DP+NC sh RNA)。行为学检测大鼠机械痛敏与热痛敏变化,检测糖水偏好率喝旷场运动总距离变化。RNA结合蛋白免疫沉淀(RIP)检测lnc RNA UC.471+与P2X7受体启动子SP1的相互作用。通过双荧光素酶实验检测SP1与P2X7受体的相互作用。通过q RT-PCR检测各组大鼠海马的UC.471+的RNA表达,P2X7受体、核因子E2相关因子2(Nrf2),转铁蛋白受体1(TFR-1),铁蛋白重链1(FTH-1)以及GPX4的m RNA表达。通过western blotting检测各组大鼠海马的P2X7受体和炎症指标肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白介素1β(IL-1β)的蛋白表达,检测铁死亡相关指标Nrf2、TFR-1、FTH-1以及GPX4的蛋白表达。通过尼氏染色检测海马神经元尼氏小体的改变。通过普鲁士蓝染色检测海马铁沉积含量。通过试剂盒检测GSH、GPX4、ROS、MDA和组织铁含量。通过透射电子显微镜检测线粒体结构与形态变化。3、建立糖尿病神经病理痛大鼠模型,通过检测大鼠血糖和疼痛行为确立模型建立成功。实验分组:正常对照组(Ctrl),糖尿病神经病理痛模型组(DNP),糖尿病神经病理痛加Cp G ODN 2088处理组(DNP+Cp G ODN 2088),糖尿病神经病理痛加Cp G ODN Control对照组(DNP+Cp G ODN Control),糖尿病神经病理痛加P2X7小干扰RNA组(DNP+P2X7 sh RNA)。行为学检测大鼠机械痛敏与热痛敏变化,通过q RT-PCR检测各组大鼠背根神经节(DRG)的P2X7受体,Nrf2,SLC7A11以及GPX4的m RNA表达。通过western blotting检测各组大鼠DRG的炎症指标巨细胞集落刺激因子(MCSF),巨细胞集落刺激因子受体(CSF1R),IL-1β,白介素6(IL-6),炎症相关Toll样受体9(TLR9)-NF-κB通路和P2X7受体的表达,铁死亡相关指标Nrf2,溶质载体家族7成员11重组蛋白(SLC7A11),血红素氧合酶1(HO-1)和GPX4的蛋白表达。通过免疫荧光技术DRG的MCSF,TLR9和P2X7受体的荧光表达。通过试剂盒检测GSH、GPX4、ROS和组织铁含量。通过透射电子显微镜检测线粒体结构与形态变化。建立神经元和卫星胶质细胞共培养细胞模型,使用高糖高脂处理的神经元作用于卫星胶质细胞,通过q RT-PCR,western blotting和试剂盒检测细胞模型中检测神经元炎性相关因子和炎性信号通路以及卫星胶质细胞的铁死亡相关指标。结果:1、实验结果显示,在CCI+CUMS组中,疼痛行为和抑郁样行为相比假手术组明显加重,脊髓P2X7、TACE、TNF-α、NF-κB和p-STAT3的表达上调,GPX4的表达下调。P2X7受体和小胶质细胞标志物OX42的共表达增强。GSH和GPX4的释放减少,ROS、MDA、组织铁含量增加。没食子酸处理后,疼痛和抑郁样行为得以缓解,P2X7-ROS信号通路被抑制,GSH和GPX4的释放增加,ROS、MDA和组织铁含量下降。2、研究结果显示,免疫共沉淀检测方法发现lnc RNA UC.471+和P2X7受体启动子SP1之间有相互作用。双荧光素酶检测发现SP1过表达促进P2X7受体的转录。原位杂交和q RT-PCR结果显示DNP+DP模型组海马的UC.471+的表达明显高于对照组。DNP+DP模型组大鼠疼痛和抑郁症行为明显加重,P2X7受体m RNA和蛋白表达水平较对对照组明显增加,免疫荧光双标实验观察到海马中P2X7受体与小胶质细胞标志物OX42存在共表达。同时,海马中TNF-α和IL-1β的表达增加以及铁死亡相关指标Nrf2、TFR-1、FTH-1以及GPX4的蛋白表达异常。经过lnc RNA UC.471+sh RNA处理后,疼痛和抑郁样行为得以缓解,炎症和铁死亡信号通路被抑制,GSH和GPX4的释放增加,MDA、ROS和组织铁含量下降。3、糖尿病大鼠的机械痛敏和热痛敏阈值降低,大鼠DRG中P2X7受体,炎症相关因子MCSF、CSF1R、IL-1β、IL-6的表达上调。同时TLR9、磷酸化(p)-NF-κB、NF-κB表达升高。此外,铁死亡相关指标Nrf2、SLC7A11、HO-1、GPX4的表达下调。而经过Cp G ODN 2088的处理后,以上指标的异常表达得以逆转。我们通过神经元和卫星胶质细胞共培养建立高糖高脂细胞模型,结果显示模型组卫星胶质细胞P2X7受体表达升高,Nrf2、SLC7A11、HO-1、GPX4的表达下调,神经元TLR9、p-NF-κB、NF-κB、IL-1β、IL-6、MCSF和CSF1R的表达上调。应用Cp G ODN 2088的处理后,改善结果与在体实验一致。结论:1、慢性缩窄性损伤和慢性不可预知性刺激可刺激大鼠产生的CP-456773 NMR痛和抑郁样行为。没食子酸可通过抑制P2X7受体及调节其下游TNF-α和NF-κB的释放以及STAT3的磷酸化,从而增加GSH和GPX4的表达,减少ROS的积聚,MDA的产生和组织铁的沉积来抑制细胞铁死亡,最终缓解神经病理痛和抑郁症共病模型大鼠的痛和抑郁样行为。2、糖尿病神经病理痛合并抑郁症模型大鼠的疼痛和抑郁症行为表现明显。长非编码RNA UC.471+在模型组大鼠海马中的表达明显升高,同时海马中P2X7受体信使RNA和蛋白的表达上调。Lnc RNA UC.471+sh RNA可降低糖尿病神经病理痛合并抑郁症模型大鼠海马P2X7受体及lnc RNA UC.471+的表达,抑制海马小胶质细胞炎性因子释放和铁死亡,缓解疼痛和抑郁症症状。3、结合我们的在体和离体实验结果,我们认为Cp G ODN 2088影响神经元MCSF、CSF1R、IL-1β、IL-6以及TLR9/NF-κB信号通路从而减少炎性因子的释放,抑制卫星胶质细胞P2X7受体介导的铁死亡,最终缓解糖尿病神经病理痛大鼠的疼痛行为。