一、研究背景结直肠癌是第三大常见恶性肿瘤,也是肿瘤相关死亡的第二大原因。新辅助放疗联合手术的治疗策略已成为直肠癌患者(Ⅱ/Ⅲ期)的常规治疗方法,术前放疗可以有效缩小肿瘤体积,增加保肛门率,从而有效改善患者的预后。然而,在临床实践中,仍有部分直肠癌患者对放疗不敏感甚至抵抗,肿瘤细胞的放射抵抗是制约疗效的主要障碍。阐明肿瘤细胞放射敏感性的分子机制已成为放射肿瘤学领域面临的主要挑战,对此进行深入研究对于提高放射治疗效果具有重要的指导意义。前期我们课题组利用CRISPR Cas9全基因组文库筛选放疗增敏靶点,结合生物信息学分析和高内涵技术,筛选出对结直肠癌细胞放射敏感性有显著影响的分子SUMO特异性蛋白酶5(SUMO specific peptidase 5,SENP5)。SENP5是SENP特异性蛋白酶家族中的一员,主要通过介导蛋白的去SUMO修饰参与细胞周期、细胞自噬和凋亡等多种生物学过程。SENP5表达失调可能导致细胞功能障碍并诱发癌症。已有多项基于临床肿瘤样本的研究报道,SENP5在肝癌、鼻咽癌和卵巢癌等肿瘤中高表达,且高表达SENP5的患者预后不良。然而,关于SENP5在肿瘤放射敏感性的研究较少,其介导的去SUMO修饰是否参与以及如何调控肿瘤放射敏感性尚不明确。因此,本研究致力于探究SENP5在结直肠癌放射抵抗中的作用及其潜在机制。二、研究内容及方法(一)敲低SENP5对结直肠癌细胞放射敏感性的影响使用实时荧光定量逆转录PCR(Quantitative Real-time PCR,q PCR)和蛋白免疫印迹(Western blot)实验方法检测正常肠道上皮细胞和结直肠癌细胞中SENP5 mRNA和蛋白表达水平。通过免疫荧光和Western blot实验,检测照后SENP5在结直肠癌细胞的亚细胞定位和蛋白表达变化。我们在HCT116和HT29细胞中构建了SENP5敲低结直肠癌细胞系,以探究SENP5在肿瘤放射抵抗中的作用。通过CCK8、克隆形成实验、细胞凋亡和周期实验对比SENP5敲低组和对照组的细胞放射敏感性。(二)SENP5在DNA损伤修复中的作用转录组测序分析照射后对照组和SENP5敲低组细胞mRNA变化,发现DNA复制和损伤修复相关的基因表达下调。利用彗星电泳和γ-H2AX免疫荧光染色检测SENP5敲低细胞的DNA损伤情况。同源重组(Homologous recombination,HR)修复和非同源末端连接(Non-homologous end-joining,NHEJ)修复报告系统用于测定SENP5敲低细胞中HR和NHEJ的修复效率。通过免疫荧光和Western blot实验,我们进一步检测DNA损伤修复通路关键蛋白表达变化。在体内实验中,我们利用结直肠癌细胞系移植瘤模型(Cell derived xenograft,CDX)探究SENP5对体内肿瘤组织放射敏感性的调控作用。最后,我们在SENP5敲低细胞中过表达野生型和去SUMO修饰功能缺失型SENP5开展挽救实验,通过CCK8、克隆形成实验、彗星电泳以及Western blot实验,评估SENP5的去SUMO修饰功能在DNA损伤修复中的作用。(三)SENP5调控DNA损伤修复的靶分子鉴定及功能研究通过SUMO蛋白组学联合SENP5免疫共沉淀质谱分析,初步锁定SENP5调控的靶蛋白H2A.Z。在H2A.Z敲低的细胞中过表达野生型SENP5,通过克隆形成实验检测肿瘤放射敏感性。随后,在HCT116和HT29细胞中,利用H2A.Z抗体进行免疫共沉淀实验检测H2A.Z与SENP5的相互作用。在293T细胞中,通过外源性免疫共沉淀实验检测二者的相互作用。此外,通过H2A.Z免疫沉淀实验检测照射后对照和敲低SENP5细胞中SUMO修饰变化。紧接着,通过染色质免疫共沉淀实验测序(Chromatin Immunoprecipitation sequencing,ChIP-seq)探究敲低SENP5对H2A.Z介导基因转录调控的影响。将H2A.ZGenetic circuits ChIP-seq数据联合转录组测序数据分析,探究SENP5下调对HR修复通路的影响。最后,利用q PCR、WErdafitinib核磁estern blot和免疫荧光实验,探究照射后SENP5敲低细胞中HR修复关键蛋白在DNA损伤修复应答情况。(四)SENP5在直肠癌患者放疗抵抗中的作用及相关性研究通过对直肠癌患者的肿瘤组织芯片进行SENP5免疫组化检测,并结合肿瘤退缩分级评分,我们探究SENP5与直肠癌放射敏感性的相关性。根据SENP5的表达程度将患者分为高表达组和低表达组,并根据临床随访资料绘制患者的生存曲线。为了进一步探究下调SENP5对直肠癌肿瘤组织放射敏感性的调控作用,我们构建患者来源的肿瘤移植瘤模型(Patient derived xenografts,PDX),监测小鼠体重和瘤体体积,对瘤体进行γ-H2AX免疫组化染色。深入了解SENP5在调控直肠癌放射敏感性的作用。三、研究结果(一)敲低SENP5可以增加结直肠癌细胞放射敏感性相对于正常肠道上皮细胞,结直肠癌细胞中SENP5的蛋白和mRNA表达水平均显著升高。因此,我们选择了SENP5高表达的结直肠癌细胞株(HCT116和HT29)进行后续的实验研究。照射后,我们观察到SENP5在细胞中表达量升高,并定位于细胞核。相比于对照组细胞,SENP5下调的结直肠癌细胞照射后增殖能力显著抑制,克隆形成率明显降低。流式分析结果表明,SENP5敲低细胞照射后G2/M周期阻滞减轻,细胞凋亡率增加。(二)SENP5通过其去SUMO功能域促进HR修复而增强辐射抵抗彗星电泳实验提示敲低SENP5加重照射后细胞DNA损伤程度,γ-H2AX免疫荧光染色表明SENP5敲低细胞的DNA损伤修复能力减弱。HR/NHEJ报告系统提示SENP5下调对NHEJ修复没有明显影响,但可以显著抑制HR修复。进一步免疫荧光实验发现,SENP5敲低细胞中HR修复关键蛋白RAD51 foci明显减少,而NHEJ修复关键蛋白53BP1 foci没有显著变化。Western blot实验也发现,SENP5敲低细胞中HR修复关键蛋白ATR、CHK1和CHK2的磷酸化程度降低。同样,在结直肠癌CDX模型中,敲低SENP5的移植瘤生长速度显著降低,且对照射更敏感。免疫组化结果也显示,照射后SENP5敲低结直肠癌移植瘤的HR修复受到显著抑制。最后,在SENP5敲低细胞中的挽救实验表明,过表达野生型SENP5可以减轻照射引起的增殖抑制并促进HR修复。然而,过表达去SUMO修饰功能缺失型SENP5则无此效果。(三)SENP5通过H2A.Z去SUMO化促进HR修复关键蛋白转录调控SUMO修饰蛋白组学联合SENP5蛋白质谱筛选出SENP5作用靶蛋白H2A.Z,并鉴定出其SUMO修饰位点(K121/K122/K126)。H2A.Z敲低细胞中进行SENP5功能挽救实验表明H2A.Z是SENP5促进放射抵抗的主要效应蛋白。随后,内源性和外源性免疫共沉淀实验表明照射后SENP5与H2A.Z结合。然而,位点突变型H2A.Z(H2A.Z-K121R/K122R/K126R)不与SENP5相互作用。H2A.Z免疫沉淀实验表明,照射后SENP5敲低细胞中SUMO修饰水平增加。紧接着,H2A.Z ChIP实验发现与对照组细胞相比,照射后SENP5敲低细胞中H2A.Z与HR修复基因TOPBP1、BRCA2和BARD1启动子结合增加。在照射后的SENP5敲低细胞中,TOPBP1、BRCA2和BARD1的mRNA和蛋白表达水平降低,细胞核内foci数量减少。(四)SENP5可以作为临床放疗标志物和潜在治疗靶点临床直肠癌患者组织芯片结果表明,对于肿瘤组织高表达SENP5的患者,放疗抵抗程度更高,且预后较差。在PDX模型中,敲低SENP5可以明显抑制移植瘤的生长速度。免疫组化染色显示,敲低SENP5可以加剧肿瘤细胞DNA损伤,抑制肿瘤组织增殖。四、研究结论综上,本研究表明SENP5是结直肠癌细胞放射抵抗的关键分子。在体内和体外实验中发现,敲低SENP5可以抑制HR修复,加重INCB018424照射后肿瘤细胞DNA损伤。通过挽救实验,发现SENP5介导的去SUMO修饰在放疗抵抗中发挥重要作用。此外,我们发现SENP5通过调节H2A.Z的去SUMO修饰促进肿瘤细胞放疗抵抗。在SENP5敲低细胞中,H2A.Z与HR修复关键基因TOPBP1、BRCA2和BARD1启动子的结合增加,导致这些分子的mRNA和蛋白表达水平降低,在DNA损伤位点的募集减少,从而抑制HR修复。临床组织芯片数据表明,SENP5表达与患者预后呈负相关。直肠癌PDX模型也进一步验证敲低SENP5可以增加肿瘤的放射敏感性。这些研究揭示了SENP5在DNA损伤反应中的分子机制,为开发潜在的结直肠癌放疗生物标志物和治疗靶点提供新的理论依据。