小麦(Triticum aestivum L.)是世界上主要的粮食作物之一,为人类提供了大约20%的能量。因此,持续提升小麦产量对保障全球粮食安全至关重要。油菜素甾醇(Brassinosteroids,BRs)作为六大植物激素之一,广泛参与调控植物生长发育的多个生物学过程。糖原合成酶激酶3(glycogen synthase kinase 3,GSK3)家族成员BIN2作为BR信号途径负的调控因子,广泛参与调控植物的发育及抗逆等生物学过程。该激酶在模式植物拟南芥和作物水稻中已有了系统的研究,是分子设计育种的重要基因资源。然而,GSK3-like激酶在小麦中的研究较少,限制了其在小麦分子设计育种中的精准应用。本研究系统解析了TaGSK3在小麦BR信号、发育表型、矿质元素吸收以及非生物胁迫响应中的功能,为全面了解小麦genetic rewiringTaGSK3的功能奠定了基础,也为合理利用TaGSK3进行小麦分子设计育种提供了重要参考。本研究取得以下结果:(1)将拟南芥中At BIN2和水稻中Os GSK2的蛋白序列在小麦中进行比对,鉴定到6个同源基因,分别位于第一和第三同源群。本研究将其分别命名为TaGSK3-1A、TaGSK3-1B、TaGSK3-1D、TaGSK3-3A、TaGSK3-3B和TaGSK3-3D。它们的蛋白序列高度一致且均包含保守的TREE结构域。利用公共的小麦基因表达量数据库分析了TaGSK3的表达模式,结果表明TaGSK3的6个同源基因在根、茎、叶、穗和籽粒中均有表达,且第三同源群上的基因表达量高于第一同源群上的基因。共表达分析显示TaGSK3广泛参与调控植物激素、植物营养以及环境胁迫相关的生物学过程。(2)通过CRISPR/Cas9介导的基因编辑构建了TaGSK3同源基因的功能缺失突变体,并通过杂交获得了多重突变体。在水培两周的苗期阶段,与野生型(Fielder)相比,Tagsk3-1a/1b/1d/3a和Tagsk3-1a/1b/1d/3d两个四重突变体的株高和根长均显著增加。Tagsk3-1a/1b/1d/3a/3d(简称Tagsk3(5))五重突变体的株高显著增加但根长无明显变化。Tagsk3-1a/1b/1d/3a/3b/3d(简称Tagsk3(6))六重突变体的株高显著增加但根长显著变短。在成熟期,Tagsk3-1a/1b/1d/3a和Tagsk3-1a/1b/1d/3d以及Tagsk3(5)的株型以及穗部相关性状均与野生型无显著差异。Tagsk3(6)表现出叶夹角增大、极度矮化、不能拔节和抽穗以及不能产生种子等表型缺陷。以上结果表明,TaGSK3参与调控小麦的多个发育表型,且同源基因间的功能是高度冗余的。(3)参考At BIN2和Os GSK2的功能获得型突变体的突变形式,在TaGSK3-3A的TREE结构域创制了点突变并转化至小麦品种Fielder中(简称Tagsk3-3a-m)。此外,构建了一个在TaGSK3-3D的TREE结构域包含自然点突变的近等基因系(简称Tagsk3-3d-m)。与野生型相比,Tagsk3-3a-m和Tagsk3-3d-m的株高、穗下节长度、旗叶夹角、分蘖夹角、穗长和千粒重均显著降低,小穗密度显著增加,且籽粒变圆,表明TaGSK3同时调控小麦的多个重要农艺性状。此外,Tagsk3-3a-m和Tagsk3-3d-m的穗下节细胞均显著变短,表明Tagsk3-3a-m和Tagsk3-3d-m通过抑制细胞的伸长降低穗下节的长度。(4)在TaGSK3的四重Ras抑制剂、五重和六重突变体中BR合成基因TaDWARF4的表达均显著下调,导致了BR信号的反馈调节,表明这些突变体均放大了BR信号。外源BR处理后,这些突变体中TaDWARF4的表达仍显著下调且叶夹角增加,表明这些突变体并未完全阻断BR信号转导。然而,TaDWARF4在Tagsk3-3确认细节a-m和Tagsk3-3d-m中的表达均显著上调。在外源BR处理下,Tagsk3-3a-m和Tagsk3-3d-m中TaDWARF4的表达及叶夹角均无显著变化,表明Tagsk3-3a-m和Tagsk3-3d-m均阻碍了小麦BR信号转导。(5)转录组数据分析显示,TaGSK3的功能缺失突变体和功能获得型突变体均显著富集到与植物激素、植物营养及环境胁迫相关的生物学过程,暗示着TaGSK3在小麦营养吸收和环境胁迫响应中也发挥作用。(6)TaGSK3的功能缺失突变体和功能获得型突变体均促进了小麦幼苗对铵根离子(NH_4~+)和磷(P)元素的吸收。TaGSK3的功能获得型突变体促进了小麦幼苗对钙(Ca)和锰(Mn)元素的吸收,而功能缺失突变体抑制了对Ca和Mn元素的吸收。这些结果表明,TaGSK3在小麦矿质元素吸收中同样发挥重要作用。(7)在干旱和热胁迫下,TaGSK3的两个四重突变体和Tagsk3-3a-m的抗旱和耐热能力与野生型均无显著差异。然而,Tagsk3-3d-m显著提高了小麦的抗旱和耐热能力。外源BR处理显著提高了野生型植株的耐热能力,但对Tagsk3-3d-m植株的耐热无影响,这表明Tagsk3-3d-m独立于BR信号途径增强了小麦的耐热能力。(8)在干旱和热胁迫下,Tagsk3-3d-m的失水率较野生型显著降低,从而增强了其在胁迫下的保水能力。此外,Tagsk3-3d-m也显著增强了小麦在干旱胁迫恢复后的吸水能力。综上所述,TaGSK3广泛参与调控小麦株型和穗部相关多个农艺性状的生长发育过程,也参与小麦矿质元素吸收和非生物胁迫响应等生物学过程,以上结果为将来利用TaGSK3进行小麦株型和抗逆的改良提供了重要参考。