小麦(Triticum aestivum L.)在全世界范围内种植广泛,是最重要的粮食作物之一。低温严重影响植物的生长发育和产量。我国黑龙江省地处高寒地区,冬季寒冷干燥,越冬期较长,限制小麦种植。东农冬麦1号(Dn1)是东北农业大学自主研发的具有极强低温抗性的冬小麦品种(返青率>85%),深入研究其抗寒机制对于丰富抗寒理论及选育抗寒作物品种,提高土地利用率具有重要意义。丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-Activated Protein Kinase,MAPK/MPK)级联是一条广泛存在于动植物和酵母等真核生物中高度保守的信号转导通路,由MAPKKK-MAPKK-MAPK三级级联组成,通过磷酸化逐级传递和放大信号,MAPK位于整个级联途径的最下游,在植物抵御逆境胁迫和激素响应中发挥重要作用。然而,MAPK蛋白在小麦抗寒应答中的作用尚不清楚。课题组前期研究发现,Dn1分蘖节磷酸化蛋白组学数据库中MPKs的蛋白水平在低温胁迫下发生明显变化。本研究利用q RT-PCR法检测了低温胁迫下Dn1分蘖节中TaMPKs的表达水平,筛选出差异表达基因TaMPK6;利用生物信息学方法分析及预测了TaMPK6的基因结构、蛋白结构、系统发育树、启动子顺式作用元件等;克隆TaMPK6基因遗传转化拟南芥获得TaMPK6过表达和回补植株并鉴定其生物学功能;对TaMPK6蛋白进行亚细胞定位;利用酵母双杂(Y2H)和双分子荧光互补(BiFC)法验证TaMPK6与TaICE41、TaCBF14和TaMYC2蛋白的互作关系。本研究揭示了低温胁迫下TaMPK6参与冬小麦抗寒途径的分子机制,为丰富小麦抗寒理论提供了依据,主要研究结果如下:(1)我们从16个小麦TaMPKs中挑选了9个受冷诱导的基因,利用q RT-PCR检测了Dn1分蘖节中TaMPKs的表达量,发现外源Me JA处理显著提高了TaMPK6在0℃(4.45倍)、-10℃(16.72倍)和-25℃(13.77倍)的表达量,筛选出差异表达基因TaMPK6。(2)TaMPK6(ID:Traes CS7D02G106400)全长为7254 bp,位于7D染色体上,包含5个内含子和6个外显子;TaMPK6的CDS区为1182 bp,编码393个氨基酸;TaMPK6是不稳定的疏水性蛋白,不存在跨膜结构域;亚细胞定位预测结果显示其定位于细胞核;TaMPK6属于TEY类蛋白激酶,C端含有保守结构域(CD-domain);TaMPK6与二穗短柄草、水稻等亲缘关系较近;TaMPK6启动子区含有响应低温和Me JA等顺式作用元件。(3)克隆TaMPK6基因遗传转化拟南芥获得TaMPK6过表达和回补拟南芥T_3代纯合植株。转基因植株的根长生长对Me JA处理敏感;转TaMPK6基因提高了拟南芥植株对Pst DC3000病菌的抗性;提高了拟南芥植株的抗寒性(-10℃/3 h),显著降低了拟南芥植株相对电导率及丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量,显著提高了脯氨酸(Proline,Pro)含量;显著提高了拟南芥植株ICE-CBF-COR通路基因的表达量。(4)转TaMPK6基因显著降低了拟南芥植株活性氧(Reactive Oxygen 获悉更多Species,ROS)的产生及积累;显著提高了编码超氧化物歧化酶(SOD)和BI 10773过氧化氢酶(CAT)相关基因的表达量及Nucleic Acid PurificationSOD和CAT的酶活性;提高了ROS的清除能力。(5)TaMPK6蛋白定位于细胞核,Y2H和BiFC法验证TaMPK6与TaICE1、TaCBF14和TaMYC2蛋白存在互作关系。